原核表达活性内源性血管生成抑制剂canstatin蛋白

2006年07月12日 中华消化杂志 2006 Vol.26 No.2 P.92-95 25 （上海）为了构建canstatin原核表达载体，表达重组人canstatin蛋白，并验证其生物学活性。研究者利用BamHⅠ和HindⅢ从重组质粒pUCm-T/canstatin上切下canstatin基因，插入表达质粒pET-22b(+)相应位点，转化E.coli BL21。异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达，SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况.超声破碎菌体，Ni-NTA柱亲和层析纯化重组蛋白，PBS对其透析复性.鸡胚尿囊膜(CAM)实验验证目的蛋白抗血管生成活性。结果重组质粒pUCm-T/canstatin在BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，电泳证实切下目的基因canstatin cDNA，将其插入质粒pET-22b(+)相应位点，转化E.coli BL21后，琼脂板上生长出多个白色菌落。挑选7个白色菌落做BamHⅠ和HindⅢ双酶切，所有菌落均切出分别对应原质粒与目的基因的2条特异性条带，证实均为阳性克隆。IPTG诱导其中1个克隆表达蛋白，SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24 000左右出现新的蛋白表达条带，诱导后1、2、3、4 h表达蛋白占菌体总蛋白百分比分别为18.2%、18.8%、23.0%和23.4%。Ni-NTA柱亲和层析后，在125、250 mmol/L洗脱液中纯化出目的蛋白。CAM实验显示重组人canstatin蛋白能抑制新生血管形成，且与剂量呈正相关。可见成功构建了canstatin原核表达载体，表达并纯化出有活性的重组人canstatin蛋白，为进一步研究其临床应用打下基础。