红细胞代用品研发现状和趋势的分析

      红细胞代用品研发现状和趋势的分析

          李宁1  吴卫星2  宋斌1

          （1.南京军区福州总医院  福州  350000

              2.军事医学科学院  北京100850）



        红细胞代用品研发的主要动力是：（1）血液供需存在着巨大缺口，全球每年采集7500万单位血液，只能满足40%的需求量[1]；（2）输血存在风险，包括血型错配、经血传播传染病和免疫性疾病，虽然现在输血比以往要完全，但仍无法将血型错配、血源疾病传染及免疫性疾病等风险降为零；（3）在特殊环境下，如创伤失血性休克的院前急救、战争及突发事件，大量伤员需要同时输血治疗时，难以组织足量血液及时到位；（4）红细胞寿命有限，我国血库标准4℃保存红细胞35天，使红细胞无法大量储存。因而，很久以来，人们一直致力于红细胞代用品的研究与发展，希望能克服红细胞固有的缺点，能够通用使用时无需配型，在室温下至少存放1年以上，没有传播传染病的风险。但是，事实说明红细胞代用品远比人们想象的要复杂。目前，全世界范围内仅有2个产品上市，5个在临床III期或II期临床研究。无论上市或临床研究中的产品都存在着难以克服的问题，不是疗效不如人意，就是毒性较大。几乎所有在国际上上市的红细胞代用品研发公司都已经或正在失去战略投资[2]。很明显，红细胞代用品的商业化路程还很长，但由于其巨大的市场潜力（预计市场超过每年70亿美元），研发的努力不会放弃。那么，未来红细胞代用品研发的出路何在？



1  红细胞代用品发展现状



        红细胞代用品的发展主要集中在2个方面，一是以血红蛋白为基础，另一是以氟碳化合物为基础的红细胞代用品，两种类型的代用品都取得了一定程度的成功。最近“化学血”研发的进展引起了医药界的关注。



1.1以血红蛋白为基础的红细胞代用品  



        以血红蛋白为材料一直是红细胞代用品研发的焦点。早在1944年，Amberson医生就曾用过没有任何修饰的人血红蛋白，结果出现严重的副作用，包括急性肾衰、血管收缩和腹痛。游离血红蛋白的毒性源于[3]：在游离状态下由四聚体结构迅速解析为二聚体和单体，导致肾功能受损；进入血管壁内皮细胞间隙清除一氧化氮，从而诱导系统或肾血管收缩造成血压升高，可能造成致命后果；通过单核细胞途径引发炎性反应；游离状态血红蛋白的2，3二磷酸甘油酯（2，3-DPG）不稳定，脱落后破坏血红蛋白精巧的氧结合和释放平衡。所以，必须通过修饰调整血红蛋白的有效分子半径，同时对粘滞度和氧结合及释放平衡等进行优化，才能制备有效安全的代用品。



        目前，有四种以血红蛋白为基础的红细胞代用品上市或进入临床研究。美国BioPure公司的Hemopure（戊二醛交联的牛血红蛋白多聚体）已在南非上市，也是迄今为止唯一以血红蛋白为基础的商业化红细胞代用品，适应症是除心脏外的其它手术[4，5]。但在英国上市（适应症是80岁以下成年人矫形手术的急性失血）却遭到有关部门质疑，担心产品的毒副作用、质量保障和临床疗效，这将影响到该产品是否能在英国上市[6]。Hemopure在美国的开发也遭遇阻力，美FDA的一个委员会近期认为尚无足够数据引用联邦法规21  CFR  50.24（无须知情同意给患者使用药物），否定了海军提出的1100人的III期临床研究申请，建议再次进行小规模II期研究  [7]。美国Northfield  Labs的PolyHeme（戊二醛交联的人血红蛋白多聚体）刚刚结束III期临床研究，其结果令人大为失望[8，9]。该研究在美国18个州的32个I级创伤救治中心进行，共有712位患者受试，适应症是有输血指正却没有血液可用的严重创伤和失血。结果分析显示实验组的死亡率高于对照组（标准救治方案），与该产品早期成功复苏极低浓度血红蛋白（<3g/dl）病人的结果[8]相去甚远。



        两种其他方法修饰的血红蛋白正在关键临床研究阶段。美国Sangart公司的Hemospan（MP4，聚乙二醇（PEG）修饰的人血红蛋白）为新一代红细胞代用品。PEG与水相互作用力较强，使血红蛋白表面形成一层水“防护膜”，能够消除免疫源性、增加有效分子半径、延长体内半衰期和提供与血液相似的粘滞度，防止血管收缩，保持正常运送和释放氧气的能力。实验证实，Hemospan在毛细血管前能够有效地保留氧，在毛细血管床释放氧气，选择性地向氧分压低的组织释放氧气。在美国和瑞典已经完成了II期临床研究[10，11]，疗效如何还要看III期临床研究。德国Curacyte公司的PHP（表面聚氧乙烯结合的人血红蛋白）II期临床研究已经结束，适应症是败血症休克，能够减少血管活性药物的使用。美国Hemobiotech公司的Hemotech（牛血红蛋白与磷酸腺苷和0-腺苷交联的产物）的动物试验结果令人鼓舞，但还没有开始临床研究[10]。



        还有其他手段修饰的血红蛋白，结果不很理想。加拿大公司Hemosol的Hemolink（O-棉子糖结合人血红蛋白，O-R-polyH）在2000年就完成了II期临床研究，但公司在2005年底申请破产，该工作停止[12]。有人尝试用2,3-DPG类似物吡多醛-5’-磷酸或双阿司匹林与血红蛋白结合，由于疗效差或副作用大停止研发。还有人探索用金属和血红蛋白的混合体，如镍-铁非对称混合物，未见临床研究报道。微囊包裹血红蛋白是一种较新的技术。含有血红蛋白的微囊通过聚碳酸酯膜突出挤压（extrusion）的技术形成，表面与容量比高于红细胞，可以快速摄取和释放氧气。动物实验显示，90%的血液置换为这种微囊也能保持循环和呼吸系统正常功能[10]。未见临床研究报道。



1.2以氟碳化合物为基础的红细胞代用品



        在1960年代，发现氟碳化合物能够溶解大量氧气，是自身体积的50%以上，是血浆溶解氧气能力的100倍，有“液体氧”之称。与血红蛋白相比，氟碳化合物有如下缺点，通过浓度梯度溶解与释放氧气，氧结合特性为线性，生理性氧分压范围较窄；使用时需要高纯度氧，不安全；很难溶于水，使用前要乳化，并难以运送水溶性的代谢产物；体内半衰期很短，由网状内皮系统清除，可能导致较严重的副作用。但也有一些优势，比较肝细胞代谢研究表明，氟碳化合物优于库存血；另外，携带和储运非常方便；不是生物制品，完全杜绝了致病因子的风险。所以，虽然40多年来仅一种产品（Fluosol，日本Green  Cross公司）由美FDA审批上市又在1993年撤销了批准，但氟碳化合物的有关研究一直没有中断。据说俄罗斯军队装备了类似产品。



        目前，美国Alliance和Sanguine公司正在研发氟碳化合物类代用品，只有Alliance的Oxygent进入临床研究。Oxygent是含有氟碳化合物、水、氯化钠和表面活性剂的纳米乳剂，能有效地分散并增加其利用度。II期临床研究效果很好，适应症是一般手术，可以快速扩充血容量，减少输血需求。然而，Alliance在III期临床研究时却将适应症改为冠状动脉手术，心肌梗塞发生率提高并出现1例死亡，研究被终止。Alliance将在2007年第一季度实施以防止大手术后肠梗阻为适应症的II期临床研究。在大手术中由于缺氧，向腹部的血流减少以保障心脏和脑等重要器官，结果消化道供氧减少，导致术后肠功能受损。已经证实Oxygent能够促进组织和器官的氧供应，显著缩短大手术后第一次肠蠕动的时间[13]。另外，作为合作伙伴，北京双鹤药业也将在2007年完成向中国FDA申报临床研究，适应症是大手术[14]。Sanguine的PHER-O2是Fluosol的第二代产品，近期目标是取代已经用了近60年的运送活体组织或器官的保护液(University  of  Washington液或UW液)。该公司正在开发第三代产品OxyRich和OxyPlus，用于治疗老年性痴呆症和减压症[15]。



1.3  “化学血”  



        于今年5月22日开始在英国举办的“化学制造100年”展览会上，人们看到一个暗红色牙膏样的东西，它前面的标签让人惊叹不已，“化学血”[16，17]。这就是由英国Sheffield大学化学系Lance  Twyman博士研发的红细胞代用品，由分枝型或树状聚乙二醇包裹铁原子组成，其大小和形状都很像天然的血红蛋白分子，创造了铁与氧气结合与释放的适当环境。“化学血”在平时是固体，使用时用水溶解即可，在这一点优于任何其它红细胞代用品。“化学血”的研究目前仅限于氧合平衡，还没有进行生物学实验。在进入临床研究前，必须解决药物代谢、体内氧合特点和安全性等等问题。虽然聚乙二醇已用于药物修饰并证实体内安全，但是作为红细胞代用品输入体内的量可能是其他药用的几倍甚至几十倍，安全问题令人关注。Twyman博士强调说，“化学血”中的聚乙二醇是分枝或树状而非简单的线性。无论如何，“化学血”上市的路还很长，也存在很大变数。

  

2存在的主要问题



          红细胞代用品的研究与开发目前面临瓶颈，最主要的问题是疗效难以确定，并存在毒副作用。其次，生产成本较高，在临床难以推行。第三，几乎所有上市的红细胞代用品研发公司已经或面临失去战略投资，经费匮乏难以支撑进一步开发。



2.1疗效难以确定    



        目前，进入III期临床研究的Oxygent和PolyHeme均由于疗效难以确定使深入研发遇到严重阻碍。所谓疗效难以确定，是因为以红细胞或生理盐水为对照都不合理，很难评价疗效。以PolyHeme的III期临床研究结果为例[8，18]。研究目的是比较使用PolyHeme的创伤伤员与接受标准治疗的创伤伤员的生存率，评价指标是第30天死亡率。为解决试验对照的矛盾，Northfield  Labs公司与FDA达成共识，采取非劣效（noninferiority）统计和评价方法，预先设定置信区间的上限为7%，也就是说试验组的死亡率不能超过早期输血伤员死亡率的7%。共有712名伤员参与了临床研究，总的结果是7.3%，超过了预置上限。但是，严格按治疗预案经治的伤员共有586个，结果为5.8%远低于预置上限。近期，Northfield  Labs将申请生物制品注册（Biologics  License  Application，  BLA）。我们认为这样的结果很难获准上市，此外，华尔街周刊曾披露过在2000年的临床研究中，有12%的PolyHeme受试者出现心梗，并有2名受试者死亡（共81名患者参加）。美国参议院财经委员会主席Chuck  Grassley就病人知情同意权问题责问FDA处置失当[19]。FDA在此压力下，势必要求公司提供更多的药效证据。当然，疗效并不是唯一问题。PolyHeme、Hemopure和Oxygent在临床研究中都有患者死亡，虽然并没有证据说明死亡与受试药品有关，但安全问题已引起广泛关注。



2.2成本较高生产规模有限    



        在研红细胞代用品的成本都比较高，临床顺应性较差，医生和病人不情愿使用。比如，在南非上市的Hemopure预计价格700-1000美元/单位[20]，比红细胞（150-200美元/单位）价格高得多。当然，代用品的价格并不能单纯的用“表面”价格来衡量，特别是突发事件的血液供应，如果包括红细胞制品的保存和携运装备等，红细胞的单位价格远不止表面上的价格，这正是代用品相对于红细胞的优势。此外，目前的生产规模也很有限，如Hemopure的生产规模仅为10万单位/年，这与需求量很不相称。可以预料，以血红蛋白为基础的代用品，无论是以过期红细胞还是以重组血红蛋白为原材料，产量不可能太大，更不可能很大程度地解决红细胞供需矛盾。以氟碳化合物为基础的代用品生产规模的扩大更有可能。



2.3研发资金匮乏    



      政府和企业都投入了大量的研发经费。直至2006年美国国会累计拨专款2200万美元研发Hemopure，旨在为美国陆军和海军发展创伤急救药物。美国百特公司（Baxter）曾与Alliance共同研发Oxgent，累计投入4000万美元[18]。研发红细胞代用品的公司至少有6家上市，曾经吸引了大量的战略投资。但是，并没有获得预期的回报，唯一上市的红细胞代用品至今没有收益，也没有装备军队。战略投资开始远离本领域，百特在2002年8月结束了Alliance公司的联盟，后者很快就没了经费。Northfield  Labs在2006年底公布了PolyHeme的III期临床研究的初步结果，导致当日股价下降了53%，之后继续大幅度下滑。实际上，Northfield  Labs是在美国上市的红细胞代用品研发公司中最后一个战略投资“堡垒”，其它公司的股价早已一泻千里[2]。从投资角度可看出红细胞代用品的市场化离我们还很远。  



3红细胞代用品的发展趋势



        红细胞代用品走入艰难困境，但是，对其需求的背景没有发生变化，研发红细胞代用品的努力不会放弃。但要走出这一困境，以下三方面必须发生显著的变化。



3.1概念的转变    



        从理论上讲，目前研发的代用品无法完全替代红细胞的作用，只是强调代用品携运氧气的功能。根据这一特点，研发的概念应该发生较大的转变，即对适应症进行调整，把急性贫血等改为血管损伤缺血或其他原因造成的缺氧。比如，由于血管损伤造成的肢端坏死、局部营养不良造成的褥疮等等。由于红细胞代用品，特别是氟碳化合物类，分子半径比红细胞小得多，可以弥散到损伤血管的远端供应氧气。因而，可以申报治疗性携氧药物而非红细胞代用品，在进一步观察安全和疗效的基础上，扩大适应症范围，最终开发红细胞代用品。



3.2临床研究标准的变化    



        目前研发的代用品基本上以创伤大出血伤员的院前急救为适应症，严格的说是有输血指正但没有血液情况下的伤员救治，机理就是纠正由于缺血造成的供氧不足。所以，从理论上讲，代用品至少能够起到红细胞的部分作用，对重要器官的供氧有积极作用，减少死亡率和致残率。但是，以血液为对照是不合适的，即使采用非劣效试验，预设较高的上限也不能客观反映代用品的疗效。所以，对照和标准都应该有较大的突破，才能使代用品的研发继续发展下去。这方面尤其需要创新思维。



3.3技术的突破    



        以血红蛋白为基础的代用品要从修饰技术上取得突破。虽然以戊二醛交联的血红蛋白多聚体技术比较成熟，但是从Hemopure和PolyHeme两个实例可以看出一些问题，很难被市场所接受。然而，PEG修饰的血红蛋白很可能是一个突破口，PEG修饰的单克隆抗体或重组蛋白药物已经有成功的实例。另外，微囊包裹技术在微环境方面模拟了红细胞，有可能成功。从发展过程来看，使用人、牛或猪的血红蛋白没有太大差别。氟碳化合物突破的方向是剂型及氧合方式。氟碳化合物水溶性极差，纳米乳化技术可以较好的解决问题，但是大规模生产较难。还有，此类代用品要结合高纯度氧使用，很不方便并有副作用，所以，氧结合方式上也要有所突破。目前，还没有这方面的任何报道。“化学血”也许能构成新的突破点，但就目前的研究阶段，任何结论都言之过早。







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