人血小板源性生长因子B链基因的克隆表达及其对猫角膜内皮细胞体外增殖的影响

2006年08月23日 中华眼科杂志 2006 Vol.42 No.5 P.415-419 9 （青岛）为了构建血小板源性生长因子B(PDGF-B)原核表达载体，表达足量的PDGF-BB蛋白，作用于体外培养的猫角膜内皮细胞，观察角膜内皮细胞增殖情况。研究者从健康剖宫产妇胎盘组织中提取总RNA，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，扩增出PDGF-B Cdna，将其克隆至含T7启动子的质粒Pet-28a(+)中，构建表达质粒Pet-PDGF-B，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达菌株BL-PDGF-B，进行PDGF-BB蛋白的表达，以Ni2+-NTA树脂对表达蛋白纯化、复性；将得到的PDGF-BB蛋白作用于体外培养的猫角膜内皮细胞，用MTT法分析其对细胞增殖的影响；通过倒置相差显微镜、透射电镜观察细胞形态变化以及细胞内部超微结构。结果经基因测序证明，成功构建出Pet-PDGF-B质粒；凝胶自动扫描分析表明，PDGF-BB在BL21(DE3)大肠杆菌中得到了高效表达，表达的PDGF-B单体蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，显示了1条特异蛋白带，相对分子质量约为27 000,MTT法证明所表达的PDGF-BB蛋白可促进体外培养的猫角膜内皮细胞增殖。可见Pet-PDGF-B原核表达载体的成功构建和PDGF-BB蛋白制备纯化为生产活性PDGF-BB蛋白及其进一步功能研究奠定了基础。PDGF-BB蛋白具有促进猫角膜内皮细胞增殖的作用。