丝裂原活化蛋白激酶特异性小干扰RNA表达载体对结肠癌细胞周期和DNA甲基化有影响

2008年09月23日 《中华消化杂志》2007年第27卷第9期 医学空间（MEDcyber.com）9月23日消息，中国研究者构建丝裂原活化蛋白激酶（MEK）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体，观察其静默效应及对结肠癌细胞SW1116生长周期和DNA甲基化的影响。研究者选择MEK不同靶点寡核苷酸片段，克隆到pGCsilencer真核表达载体中。脂质体转染SW1116细胞，荧光显微镜评估转染效率，G418筛选稳定表达siRNA的细胞。Western印迹法检测siRNA对MEK蛋白表达的静默效果。应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测细胞生长活力，流式细胞术分析细胞周期，甲基化特异性PCR和DNA测序检测p16^INK4A基因启动子甲基化状态。研究结果发现，构建2个靶点的MEK重组质粒，分别转染和联合转染SW1116细胞，转染效率约为72．1％，G418筛选培养2周得到稳定表达MEK siRNA的细胞，MEK蛋白抑制率分别为74．2％和69．1％和90．2％，下游分子ERK蛋白磷酸化水平随之降低；细胞增殖活力下降2～4倍和细胞周期阻滞于G1期，细胞周期负调控冈子p16^INK4A启动子区呈低甲基化状态。由此，研究者得出结论，MEK特异性siRNA表达载体对结肠癌细胞MEK蛋白表达有一定的静默效果，多靶点联合效果更好，阻滞细胞周期于G1期，促进p16^INK4A基因去甲基化。