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9月11日，Science发表抗癌药物前体合成最新成果，来自斯坦福大学的研究人员鉴定了稀有植物盾叶鬼臼中鬼臼毒素合成途径中的关键酶，并在烟草中进行异源表达，首次成功合成抗癌药物依托泊苷的前体物质依托泊苷糖苷配基。
每一次技术的革新总会带来新的文明，就像蒸汽机的发明标志着第一次工业革命的诞生。相信抗疟疾药物青蒿酸的异源合成堪称合成生物学的重要革新，在一定程度上也象征着天然产物异源合成革命的诞生。临床所需大量药物都来源于植物天然产物，然而它们的生物合成基因却鲜为人知，严重地阻碍了异源合成辅助药物生产。虽然在异源宿主中进行天然产物的合成需要解决各种难题，然而破译所需的生物催化剂是首当其冲的问题。目前已知合成途径并已经实现或在未来有望实现在异源宿主中工业化生产的天然产物屈指可数，仅有青蒿酸、苄基异喹啉生物碱类以及单萜吲哚生物碱类。然而最新一期的Science再次为合成生物学带来了新的希望，来自斯坦福大学的研究人员鉴定了稀有植物盾叶鬼臼中鬼臼毒素合成途径的关键酶类，并将其在烟草中表达，最终首次合成了依托泊苷的前体物质——依托泊苷糖苷配基，为依托泊苷的获取提供了一种更安全、有效的方式。作为抗癌药物的前体物质，依托泊苷糖苷培基仅需一步化学合成便可得到临床所用的药物，必然广受关注，那么它的异源合成是怎样实现的呢？
1. 异源合成植物天然产物的必要性
目前有效的药用植物代谢产物都来源于植物提取，人类从植物中获取药品的历史由来已久，即使今天依然有大约一半的新药来自于植物。但是植物固有生长缓慢的缺点，有些又属于处于濒危状态的稀有植物，给植物源药物的应用带来困难。喜马拉雅盾叶鬼臼就是一个很好的例子，其自身能够合成抗癌药物依托泊苷的前体鬼臼毒素，美国自1983年起，便广泛将依托泊苷应用于肺癌、淋巴癌等癌症的治疗。现今鬼臼毒素主要是从美国盾叶鬼臼获得，但是较长的生长周期和较低的产量限制了该药物的广泛使用。如果实现异源合成，规模化培养易于操作的宿主，如烟草、酵母以及大肠杆菌等细胞，相信不只能推动合成生物学的革命浪潮，更将成为造福人类医疗健康的宏伟工程。
2. 依托泊苷与破译工作的意义究竟是什么？
依托泊苷作是由活性天然产物鬼臼毒素经半合成得到的衍生物，通过抑制拓扑异构酶II来引起DNA双链断裂，阻止癌细胞的快速分裂，因此被用于化疗多种恶性肿瘤而广泛应用于临床。虽然依托泊苷被世界卫生组织列为必须的关键药品，但其生产过程还是依赖于从盾叶鬼臼中提取前体物质鬼臼素，再进行化学法半合成。
因此迫切需要拓宽依托泊苷前体的来源，首先当然需要解决最大的障碍，破译盾叶鬼臼中的鬼臼素合成基因。相信这是作者的初衷，然而最后的结果中，得到破译的途径终产物并不是鬼臼素，而是鬼臼素途径中的另一个物质，依托泊苷糖苷配基（4′-desmethylepipodophyllotoxin）。这个物质比鬼臼素更适合进行依托泊苷的合成，也就是免去了在化学合成中对鬼臼素进行异构化和去甲基化的步骤，直接合成依托泊苷。
3. 依托泊苷(etoposide)前体物质合成途径的破译过程
在盾叶鬼臼中进行基因探矿是非常困难的，因为这种稀有植物生长缓慢、基因组庞大（约16Gb）,未测序，而且构建突变体的方法十分繁琐。文章主要采用RNA-seq分析、预测蛋白共表达以及质谱分析的方法来破译依托泊苷糖苷配基合成的相关酶。由于烟草能通常能正确表达不同的蛋白，同时具有快速生长、易于操作的优点，被选为备选基因异源表达的宿主。经过已知蛋白DIR、PLR、SDH与CYP718A23在烟草中共表达以及质谱分析中间产物后，Sattely团队发现为烟草细胞提供底物马台树脂醇（matairesinol）后更能有效积累中间产物pluviatolide（图1），因此以此底物为出发点，启动了鬼臼素（podophyllotoxin）的破译旅程。
盾叶鬼臼合成鬼臼毒素用于保护自身免受病虫害侵染，只有当叶片受到伤害时，鬼臼毒素才会合成。Sattely团队进而推测与伤害应激反应相关的蛋白可能参与到鬼臼毒素的合成,通过比较叶片受伤前后RNA-seq数据，检测蛋白的表达水平，并预测需要填补空缺反应的酶类:O-甲基转移酶（OMTs）、细胞色素P450(CYPs)、2-氧戊二酸依赖的双加氧酶（2-ODDs）以及多元酚氧化酶（PPOs）(图2)。那如何寻找到负责这六个酶合成的基因呢？基于表达谱的计算分析生成了7个候选基因。研究者进一步通过酶家族分类筛选盾叶鬼臼中34,384个基因后，对RNA-seq数据进行了分级群聚，分析了336个基因，揭示了一个进化枝上的91个基因，进一步通过表达水平分析将这个进化枝浓缩为22个基因，其中包含了6个已经推测的候选基因。因此研究者以马台树脂醇为出发底物逐步在烟草中共表达6个候选基因，破译了依托泊苷前体依托泊苷糖苷（4′-desmethylepipodophyllotoxin）配基的途径，并在烟草中共表达整条途径的10个基因，获得了依托泊苷糖苷配基的异源合成,目前产率为10.3ng/mg烟草干重。
当然异源合成最终目的还是要走向酵母宿主的，目前是否已有研究团队正在努力中呢？我们将持续关注。
摘译自：http://www.sciencemag.org/content/349/6253/1224?related-urls=yes&legid=sci;349/6253/1224
