蛋白质间相互作用研究方法1

放射标记蛋白探针的制备

1．在微量离心管中制备下列反应混合物：

[γ-32P] ATP（6000 Ci/mmol）         5μl

蛋白激酶A                          1 unit/μl

在谷胱甘肽琼脂糖上的GST融合蛋白    1～3μg

2×PK缓冲液                        12.5μl

水                                  到25μl

反应混合物在37℃孵育30 min。

2．标记反应完成后，加入200μl的1×PK缓冲液到离心管中清洗琼脂糖珠，然后在微量离心机上以最大速度离心1 min。用适当的方式将含游离放射性核酸的上清弃去，再重复清洗一次。

3．用一种蛋白酶切下标记蛋白质，或用20mmol/L还原型谷胱甘肽于50mmol/L Tris (pH8.0)中，将标记GST融合蛋白从琼脂糖珠上洗下。将标记蛋白存放在冰盒中，在同一天中使用。

4．在标记反应前如果标记蛋白与GST成分分开，就将标记蛋白上用1×PK缓冲液平衡的Sephadex G-50柱，以除去游离的标记核酸。探针蛋白一旦与游离核酸分开，就可使用。将标记蛋白放在冰盒中，在同一天使用。

探测膜

5．用标准技术将蛋白质转移到膜上，制备待检测的膜。

6．用碱性缓冲液完全覆盖膜并在4℃轻轻振荡清洗10min。

7．弃去碱性缓冲液，用封闭缓冲液完全覆盖膜，并在4℃轻轻振荡孵育4 h过夜。