高效液相色谱法测定利福霉素钠含量与有关物质

摘要：目的 建立高效液相色谱法测定注射用利福霉素钠含量及其有关物质的方法。方法 色谱柱：Alltech Alltima C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：35℃；流动相：甲醇：乙腈：0.075mol／L磷酸二氢钾溶液：1.Omo／L柠檬酸溶液(33：33：31：4)；流速：1.Oml／min；检测波长：254nm；进样量1Oμl。结果 利福霉素的线性范围为0.01mg／ml～4.50mg／ml，r=1.0000，日内RSD为0.2％，日问RSD为0.1％～0.2％。平均回收率为99．7％(n=9)，最低检测限为5.4ng。结论本方法简便快速，专属性好。精密度高。准确可靠，可作为控制利福霉素钠与注射用利福霉素钠含量及其有关物质质量的分析方法。
关键词：高效液相色谱法；利福霉素钠；含量测定；有关物质
利福霉素钠属安莎类抗生素，是半合成的利福霉素中的广谱抗生素，也是国内惟一供注射用的利福霉素类药物，对金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌有较强的杀菌作用。是目前临床九大抗结核药物的首选药物。由于利福霉素钠结构复杂、不稳定、容易产生降解杂质，主要杂质为利福霉素S与利福霉素B，其含量测定法目前各国一般采用微生物检定法，但微生物检定法专属性较差，且操纵繁杂、费时。利福霉素钠的HPLC含量测定方法未见相关文献报道。作者建立了一种高效液相色谱法测定利福霉素钠的含量。该方法简便、快速、精密、准确，并能同时测定其有关物质。该HPLC方法测定有关物质时较《英国药典》方法简便，专属性强，能分离出更多的杂质，结果满意。该方法亦可用于利福霉素钠制剂的测定。
1 仪器与试药
1．1 仪器
Waters2695-2996液相色谱仪(美国Waters公司)，Empower色谱工作站；ZY-300IV多功能微生物自动测量分析仪(北京先驱威锋技术开发公司)；Alltech Alltima Cl8(250mm ×4.6mm，5μm)；Alltech Alltima C8(250mm×4.6mm，5μm)。
1．2 试药
利福霉素标准品(批号0333—200006，832μg／mg)、利福霉素S(130539 200301)和利福霉素B(130540 200301)均由中国药品生物制品检定所提供；利福霉素钠原料分别由郑州民众制药厂与辅仁药业有限公司提供，批号分别为030512、030520、030528与200305001、200305002、200305003；注射用利福霉素钠(批号为021128，规格0.25g)由河南四方药业提供；培养基为I号6.0～6.5，批号：021112(北京三药科技开发公司生产，中国药品生物制品检定所监制)；菌种为藤黄微球菌[CMCC(B)28001](中国药品生物制品检定所)；甲醇与乙腈为Merck公司生产(色谱纯)，其余试剂均为分析纯。
2 色谱条件
色谱柱：Alltech Alltima Cl8(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：35℃；流动相：甲醇：乙腈：0.075mol／L磷酸二氢钾溶液：1.0mol／L柠檬酸溶液(33：33：31：4)；流速：1.0ml／min；检测波长：254nm；进样量10μl。
3 方法与结果
3．1 检测波长的确定
取利福霉素标准品、利福霉素B对照品与利福霉素S对照品，加溶剂(乙腈：水=50：50)溶解并稀释成含利福霉素SV、利福霉素B与利福霉素S分别为0.2、0.1与0.1mg／ml的溶液，进样后记录色谱图，提取利福霉素SV、利福霉素B与利福霉素S色谱峰的二极管阵列色谱图与光谱图，结果利福霉素SV、利福霉素B与利福霉素S在230～400nm均有强吸收，同时参照《英国药典)2OO2年版利福霉素钠有关物质的检测波长254nm，最终选择通用波长254nm
为含量测定的检测波长。
3．2 分析方法的选择
精密称取利福霉素标准品、利福霉素B对照品与利福霉素S对照品，加溶剂(乙腈：水=50：50)溶解并稀释成含利福霉素SV、利福霉素B与利福霉素S分别为0.2、0.1与0.1mg／ml的溶液，进样后记录色谱图。
3．2．1 流动相的选择 利福平为利福霉素的3-[[(4-甲基-1-哌嗪基)亚氨基]甲基]衍生物，因而参照利福平的高效液相色谱条件，选用流动相组成为甲醇：乙腈：0.075mol／L磷酸二氢钾溶液：1.0mol／L柠檬酸溶液(3O：30：36：4)，在此基础上进行色谱条件的优化。
3．2．2 色谱柱的选择参照利福平含量测定方法，选择C8色谱柱进行测定，结果利福霉素SV与利福霉素B的分离度为1.3，不能达到基线分离。改用C18柱，利福霉素SV与利福霉素B的分离度达到4.9，峰形良好，结果满意。
3．2．3 流动相中有机相比例的选择 在上述色谱条件下，利福霉素S的保留时间较长(57min)，不利于含量测定。在其他条件不变的前提下，调整流动相的比例为甲醇：乙腈：0.075mol／l磷酸二氢钾溶液：1.0mol／l柠檬酸溶液(33：33：31：4)，结果利福霉素S的保留时间为30min，利福霉素SV与利福霉素B的分离度为3.1，色谱峰分离理想，峰形良好，可满足利福霉素含量与有关物质测定的需要。为兼顾色谱峰的有效分离与分析速度，最终确定流动相的组成为甲醇：乙腈：0.075mol／L磷酸二氢钾溶液：1.0mol／L柠檬酸溶液(33：33：31：4)。
3．3 分析方法的专属性
在选定的色谱条件下，进样利福霉素SV、利福霉素B与利福霉素S的混合溶液，在上述色谱系统中对其色谱峰进行检查，并用光电二极管阵列紫外检测器对其加以色谱峰纯度分析，同时对常规样品的色谱峰进行色谱峰纯度分析。结果表明利福霉素SV、利福霉素B与利福霉素S色谱峰均为单一纯色谱峰，本色谱系统能将样品中的杂质与主组分有效地分离。
3．4 线性范围
精密称取利福霉素标准品，加溶剂(乙腈：水=50：50)溶解并稀释成下列浓度：0.009、0.225、0.45、0.90、1.35、1.8O、2.25mg／ml；进样1Oμl，记录色谱图，以峰面积与浓度进行线性回归，得回归方程为Y=1578749.3 -64917.2，r=1.0000，说明利福霉素浓度和色谱峰面积的线性关系良好。
3．5 检测限和定量限
精密称取利福霉素标准品，加溶剂(乙腈：水=50：50)溶解并稀释至lμg／ml，进样1Oμl，本方法的检测限按信噪比3：1为5.4ng，定量限按信噪比10：1为18.1ng。
3．6 精密度
在上述色谱条件下在同一天对同一样品溶液进行5次测定，日内RSD为0.2 。
3．7 重现性
取3个不同批号的样品，在上述色谱条件下分别在3d测定含量，日间RSD分别为：0.2 、0.1 、0.1%(n=3)。
3．8 溶液的稳定性
取上述利福霉素溶液(0.45mg／m1)，于室温下分别放置0、1、2、4、6、8h，在上述色谱条件下测定利福霉素峰面积的RSD为1.5%；结果表明利福霉素的含量测定溶液稳定。
3．9 准确度
精密称取利福霉素标准品，加溶剂(乙腈：水=50：50)溶解并稀释至下列浓度：0.36、0.45、0.54mg／ml；各测定3次，测得的平均回收率为99.7%，RSD=O.2% (n=9)。
3．1O 样品含量测定
3．10．1 HPLC 法 精密称取利福霉素标准品(83.2%)，加溶剂(乙腈：水=50：50)溶解并制成0.5mg／ml的溶液，作为对照品溶液；另精密称取利福霉素原料适量，加溶剂(乙腈：水=50：50)溶解并制成0.5mg／ml的溶液，作为供试品溶液。分别精密吸取上述溶液1Oμl注入液相色谱仪，记录色谱图，用外标法以峰面积计算。
3．10．2 微生物检定法 参照《中国药典》2000年版二部附录XIA抗生素微生物检定法与国家药品监督管理局国家药品标准WS一10001一(HD一0137)一2002L3]，选用培养基为I号6.0～6.5，菌种为藤黄微球菌，高、低溶液浓度分别为2μg／ml与lμg／ml，测定结果。
3．11 样品有关物质测定
3．11．1 本文建立方法 精密称取利福霉素B对照品与利福霉素S对照品，加溶剂(乙腈：水=50：5O)溶解并稀释成利福霉素B与利福霉素S分别为5和20μg／ml的溶液为对照溶液；精密称取利福霉素标准品与原料适量，加溶剂(乙腈：水=50：50)溶解并制成1.0mg／ml的溶液为供试品溶液。分别精密吸取上述溶液2μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算样品中利福霉素B与利福霉素S及其其他杂质的含量。
3．11．2 英国药典方法 精密称取利福霉素B0.0100g用混合溶液(pH7.8)溶解并稀释至200ml；精密称取利福霉素S 0.0100g用混合溶液溶解并稀释至5Oml，然后分别精密吸取5.0ml，同置50.0ml容量瓶中，加混合溶液稀释至刻度，作为对照溶液。分别精密称取利福霉素原料适量，用混合溶液溶解并稀释至1.0mg／ml的溶液，作为供试品溶液。按《英国药典》2002年版方法，分别精密吸取上述溶液2Oμl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算样品中利福霉素B与利福霉素S及其其他杂质的含量。
4 讨论
高效液相色谱法测得的利福霉素钠样品的含量结果偏高，扣除水分后的结果高于100%，是因为利福霉素标准品标化时采用方法为微生物效价检定法，所测效价为利福霉素SV与利福霉素B、利福霉素S及其其他活性杂质的总和，同时由HPLC法归一化结果可知利福霉素标准品的杂质较多。因此利福霉素标准品中利福霉素SV的含量低于其标示量(832μg／mg)，导致所测样品的HPLC法含量结果偏高。
本文建立HPLC方法中利福霉素SV 的最低检测限为5.4ng，若供试品溶液为1.0mg／ml，进样2Oμl，则杂质的最低可检出量为0.03%，完全可满足有关物质测定的需要，该方法检出的杂质量与杂质个数均多于英国药典方法，说明该方法专属性更强。注射用利福霉素钠含量(标示量)虽然符合规定，但归一化含量较低，为87.9%，HPI C法测定的纯度为64.8%，通常采用高限投料解决含量问题，其中所含杂质很多，杂质总和高达12.4%，杂质个数为10个，注人人体必然产生众多不良反应，可见建立简便易行、准确而专属的方法控制利福霉素钠及其制剂的有关物质限度的必要性。
参考文献
[1]The British Pharmacopoeia Commission．British Pharmacopoeia [s]．2002：1 307
[2]中华人民共和国药典委员会．中华人民共和国药典(二部)[s]．2000年版，北京：化学工业出版社．2000