高效液相色谱测定司帕沙星胶囊含量方法的改进

　　［摘要］目的：在3种ODS柱上对司帕沙星胶囊进行高效液相色谱法的色谱行为测试。方法：采用RP-HPLC法，以V（0.25%磷酸,用三乙胺调pH至3.0）∶V（乙腈）=70∶30为流动相，以氧氟沙星作为内标，检测波长298nm，在9.9～79.2μg/ml范围内线性关系良好（r=0.9995）。结果：该法简便、快速、准确、重现性好。结论：此法有利于从宏观上把握喹诺酮类药物的色谱行为规律，减少不必要的实验条件和次数，对ODS色谱柱的选择和分离度的改善均有指导意义。
　　［关键词］高效液相色谱法；司帕沙星；氧氟沙星
　　［中图分类号］R927.2；R978　　［文献标识码］B
　　［文章编号］1003-3734(2000)11-0772-02

Improvement in HPLC determination of sparfloxacin in capsules

YIN Qiang
(Changzhou Institute for Drug Control,Changzhou 213003,China)

［Abstract］Objective:To study the chromatographic behaviours of sparfloxacin in capsules on 3 ODS columns.Methods:The chromatographic behaviours of sparfloxacin in capsules were studied on 3 ODS columns.A mobile phase consisted of acetonitrile∶0.25% phosphoric acid (pH was adjusted to 3.0 by triethylamine)=30∶70 by volume,an UV detector at 298 nm and an internal standard,ofloxacin,were adotped.Results:An accurate and reproducible results with a linear range of 9.9～79.2μg/ml(r=0.9995) were obtained.Conclusion:The study is helpful in HPLC determination of quinolones in the following aspects:to recognize chromatographic behaviour,to optimize chromatographic conditions and to select internal standards.
［Key words］HPLC；sparfloxacin；ofloxacin

　　 司帕沙星胶囊为新型喹诺酮类广谱抗菌药，对呼吸系统、肠道、胆道、泌尿生殖系统感染等具有很好的疗效。卫生部试行标准收载了该药的检测方法（简称原法），但实验中发现该法色谱图主峰在一般的ODS柱上拖尾严重，按外标法计算，结果误差较大。经实验摸索，改变了流动相缓冲液的成分，以氧氟沙星作为内标，检测并选出最佳分离条件，使主峰与内标峰达到基线分离，消除主峰与内标峰的拖尾，结果令人满意，现介绍如下。

1　仪器、药品和试剂

　　岛津LC-10AD高效液相色谱仪，SPD-10A紫外检测器，C-R6A记录仪。
　　司帕沙星对照品（含量98.80%）及其胶囊（由浙江海正药业股份有限公司提供，批号：980602，990301），氧氟沙星对照品由江苏省常州市聚荣药业股份有限公司提供，乙腈为色谱纯，三乙胺等试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1　色谱条件 　色谱柱：ODS-A 120A（6.0mm×150mm，5μm，日本YMC公司）。流动相：V（体积分数为0.25%的磷酸溶液，用三乙胺调pH至3.0）∶V(乙腈)=70∶30，流速1.5ml/min。检测波长298nm，柱温30℃，灵敏度0.05AUFS。在上述色谱条件下，主峰与内标峰得到有效的分离，分离度为3.8，见图1。

1 氧氟沙星（内标）；2 司帕沙星
图1　司帕沙星HPLC色谱图

2.2　标准溶液的准备　对照品溶液：精密称取司帕沙星对照品适量，置于25 ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释制成0.4mg/ml的溶液。内标溶液：精确称取氧氟沙星对照品适量，置于25ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释制成0.4mg/ml的溶液。
2.3　线性关系考察　精密量取对照品溶液0.25,0.50,1.0,1.5,2.0ml分别置于10ml量瓶中，各精密加内标溶液0.50ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，分别进样20μl，进行色谱分析，经直线线性回归，得回归方程为：Y=0.03797X-0.02078, r=0.9995。
　　结果表明，司帕沙星浓度在9.9～79.2μg/ml范围内，呈良好的线性关系。
2.4　精密度测定　分别精密量取前项下的对照品溶液0.50ml与内标溶液0.50ml，置同一10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，进样20μl，连续进样8次，测得校正因子为1.2421，RSD为0.4%，其精密度良好。
2.5　加样回收率　向已知含量的样品加入一定量对照品，依法测定其含量，重复5个样品测定，司帕沙星回收率为98.9%，RSD为0.64%。
2.6　样品测定　取本品20粒，去除囊壳，内容物混匀，精称适量（约相当于司帕沙星25mg）置50ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度。精密量取该溶液0.50ml与内标溶液0.50ml，置同一10ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，0.45μm滤膜过滤，进样20μl测定，结果见表1。

表1　样品测定结果(n=4)

3.1　流动相的选择　原法流动相中采用磷酸盐缓冲液，本实验采用不含盐类的缓冲液，不但简化了操作步骤，而且对色谱柱也起到了保护作用。由于司帕沙星和氧氟沙星均为碱性药物，在流动相中加入扫尾剂三乙胺，可抑制或掩蔽固定相表面的游离硅醇基的活性，使碱性药物易于出峰，且峰形较好，就多数碱性药物来说，选用pH为3.0的缓冲液较为适宜，若pH值再升高则碱性药物在柱上的保留时间将延长，增加了分析所耗的时间^［1］。在实验中，我们把缓冲液与乙腈的体积之比分别调至85∶15，80∶20，75∶25及70∶30。结果表明，随着乙腈浓度的增大，主峰与内标峰之间分离情况逐渐改善，至70∶30时，分离良好，主峰与内标峰无拖尾现象。故认为V（体积分数为0.25%的磷酸-三乙胺缓冲液，pH为3.0）∶V（乙腈）=70∶30为优化流动相。
3.2　色谱柱的选择　在实验中，我们发现不同牌号的色谱柱对本品测定结果影响很大。在美国惠普公司的ZORBAX ODS C₁₈（4.6mm×150mm，5μm）柱上，无论改变流速、pH值及乙腈与缓冲液的体积比，均无法改变主峰与内标峰严重拖尾现象。这是由于普通柱中，固定相表面的游离硅醇基对碱性药物的色谱行为产生了严重的影响。为此，我们选用了美国惠普公司的ZORBAX SB-C₁₈（4.6mm×150mm,5μm）色谱柱和日本YMC-pack,ODS-A,120A(6.0mm×150mm，5μm)色谱柱，它们均采用特殊的基团封端技术，避免未反应的硅醇基与碱性物质相互作用，引起峰拖尾。司帕沙星与氧氟沙星在3种ODS色谱柱上的分离性能见表2。

表2　3种ODS色谱柱的分离性能

［作者简介］殷强(1966-)，男，副主任药师，主要从事高效液相色谱分析。
殷强(常州市药品检验所，常州　213003)

［参考文献］

［1］李修禄.用HPLC法分析碱性含氮有机药物的进展［J］.国外医学药学分册，1991，18（5）∶265-269.
［2］梁贵键，朱莉，邹凤君，等.根据色谱保留值与流动相pH值的函数关系对212种常用药物的分类［J］.色谱，1996，14（3）∶196-198.

收稿日期：2000-02-21

修回日期：2000-08-16