高效液相色谱法测定淀粉类食品中丙烯酰胺研究色谱分析实例 | 39康复网

刘红河,陈春晓,柳其芳,何彩,刘小立 (深圳市疾病预防控制中心,广东　518020) 摘　要　〔目的〕研究检测淀粉类食品中丙烯酰胺的高效液相色谱测定方法,用于实际样品测定。〔方法〕用水提取食品中丙烯酰胺,采用固相萃取小柱对样品液进行纯化,以二极管阵列高效液相色谱法测定其含量。〔结果〕方法检出限为10ng/ g ,回收率在80. 0 %～115. 0 %之间,精密度为5. 34 %(低浓度) 、3. 40 %(中等浓度) 和4. 30 %(高浓度) 。〔结论〕该方法测定食品中丙烯酰胺具有操作简单、干扰少、快速、准确可靠等特点,可以用于食品中丙烯酰胺测定的推广应用。关键词　丙烯酰胺；食品；高效液相色谱法；固相萃取技术　　2002 年4 月,瑞典斯德哥尔摩大学的Margareta Tornqvist 教授首次在油炸及焙烤的马铃薯和谷物类食品中发现了具有神经毒性的潜在致癌物- 丙烯酰胺(Acrylamide) ,这是国际上首次从食品中检出高含量的丙烯酰胺[1 ] 。这次在食品中检出足以对人体健康产生危害的量,引起了包括世界卫生组织等国际机构的重视。世界卫生组织在瑞士日内瓦召开关于丙烯酰胺专家会议,专门商讨食物中丙烯酰胺问题的重要性。食品中丙烯酰胺的产生机理,目前基本得到确认的是由食品中天门冬酰胺和还原性糖在高温加热过程中通过美拉德反应(Maillard reaction) 而生成,食品加热到120 ℃以上即可发现丙烯酰胺的生成,加工方式对丙烯酰胺的产生影响很大[2 ,3 ] 。由于丙烯酰胺已被WHO 国际癌症研究中心( IRAC) 列为可能致癌物质[4 ] ,动物实验和体外细胞实验都证明丙烯酰胺可导致遗传物质的改变和癌症的发生[5 ] 。因此该研究目前已引起包括欧盟、FAO、WHO 等政府和国际组织的广泛关注。但这些研究均处于刚起步阶段。在我国,到目前为止,仅见有关食品中丙烯酰胺的新闻报道,具体的研究还是空白。食品中丙烯酰胺的检验已列为我国“十五”国家重大科技专项“食品安全关键技术”课题,卫生部食品安全计划也将食品中丙烯酰胺检测方法的建立和我国食品丙烯酰胺分布调查作为一个重要部分。目前,国际上食品中丙烯酰胺测定方法主要为气相色谱- 质谱联用法和高效液相色谱- 质谱联用法两种方法,对仪器设备要求较高。本文在查阅文献[6 - 8 ]的基础上建立了食品中痕量丙烯酰胺的高效液相色谱测定法,采用固相萃取法对样品进行净化,该法简单、快速、灵敏、准确,适合批量检测。通过对实际样品进行检验,取得了令人满意的效果。现报告如下: 1 　实验部分 1. 1 　本岛津LC - 10A 高效液相色谱仪,配二极管阵列检测器；离心沉淀机,0～5000r/ min ；0. 45μm水系针筒式微孔滤膜过滤器；Milli - Q plus 超纯水系统(美国密理博公司) ；丙烯酰胺标准,纯度大于99 %(美国Sigma 公司) 。丙烯酰胺储备液浓度为1000mg/L 甲醇溶液,存放于- 20 ℃冰箱中,丙烯酰胺标准应用液浓度为1. 0mg/ L 的水溶液(临用新配) ；LC - C18 PK/ 54 固相萃取小柱(美国Supelco 公司) 。试剂除注明外均为分析纯。试验用水为二次蒸馏超纯水。 1. 2 　色谱条件　色谱柱:美国Aglient 公司Aglient XDB 反相C18柱,20cm×4. 6mm i. d. ,5μm；流动相甲醇:水(体积比为5 :95) ,流速0. 8ml/ min ；柱温40 ℃；检测波长210nm；光谱扫描波长190nm～370nm；进样体积5μl 。 1. 3 　样品处理　称取均质化食品样品约2. 00g 于20ml 塑料离心管中,加水至10ml ,旋涡振荡20min ,4000r/ min 离心20min ,取上清液(避开油层) 5ml 经0. 45μm 水系针筒式微孔滤膜过滤器过滤后,取1. 5ml 滤液过事先用甲醇和水处理过的SPE 小柱,弃去最初0. 5ml 流出液,收集流出液进样测定。 2 　结果与讨论 2. 1 　仪器条件的选择　比较了几种流动相,分别为甲醇、甲醇:水(10 :90) 、甲醇:水(5 :95) 甲醇:乙酸:水(0. 5 :0. 1 :99. 4) ,发现甲醇:水(5 :95) 条件下丙烯酰胺和样品中干扰物能达到较好基线分离；在0. 2ml/ min～2. 0ml/ min 范围内改变流动相流速,发现在流速为0. 6ml/ min～1. 20ml/ min 丙烯酰胺出峰时间合适,峰形较好；对丙烯酰胺标准溶液用紫外光谱仪进行扫描,其在210nm处有个最大吸收峰(图3) ；进样量大可提高测定的灵敏度,但实验中发现,当进样量达到10μl 以上时,峰形将发生分散、拖尾等现象。综合考虑,我们确定测定的色谱条件为:流动相为甲醇:水(5 :95) ,流速0. 80ml/ min ,柱温40 ℃,检测波长210nm；进样量为5μl ,测定结果令人满意。此条件下丙烯酰胺的保留时间为4. 95min ,标准及样品色谱图分别见图1和图2。 2. 2 　萃取条件确定　比较了活性炭和C18固相萃取小柱等几种萃取吸附剂。发现活性炭吸附剂对强极性丙烯酰胺有很好的保留特性,对样品中待测物有较大的浓缩作用,但由于其对食品样品中所有成份均有吸附作用,因此对样品中共存的干扰物质分离效果较差；固相萃取小柱对丙烯酰胺基本无吸附,而对样品液中共存物质有较好的保留,可有效地除去样品液中蛋白质等干扰物质,缺点是对样品液中待测物质无浓缩作用。由于食品中共存物质对测定有一定的干扰,影响测定结果的稳定性,且对色谱柱寿命影响较大,而本研究方法的灵敏度基本上可达到不必浓缩即可对食品样品中丙烯酰胺进行测定的要求,因此本研究采用C18固相萃取小柱对样品进行纯化处理。我们对高中低三种不同浓度的丙烯酰胺标准溶液各七份分别同时进行直接测定和过固相萃取柱后测定,发现两种处理方法的测定结果之间无显著性差异,丙烯酰胺的回收率在95 %以上,因此实际测定时采用对标准溶液直接测定的标准曲线进行定量。固相萃取时采用真空泵抽滤时,我们发现回收率相对常压下过滤有不同程度的下降,因此实际应用中采用自然滤过,这样样品处理时稍微延长,但测定结果较好。 2. 3 　标准曲线的绘制　将标准应用液分别配制为0. 1 ,0. 5 ,1.0 ,2. 0 ,5. 0 ,7. 0 ,10. 0μg/ ml 等不同浓度的丙烯酰胺标准溶液进样分析,以质量浓度(μg/ ml) 为横坐标,以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。线性方程y = 76647. 74x - 6569. 00 ,相关系数r 为0. 9981 ,峰面积与质量浓度之间有良好的线性关系。 2. 4 　定性方法　采用标准物质的保留时间和峰扫描光谱纯度对照两种方式对样品峰进行准确定性。由于不少物质在210nm波长处有吸收,只有同时满足两个条件的物质,我们才认定为待测的丙烯酰胺。丙烯酰胺的扫描光谱图见图3。 2. 5 　方法的回收率和精密度　对六份样品分别采用高、中、低三个浓度水平进行了丙烯酰胺的加标回收实验,结果见表1。从表中可看出,样品加标回收率在80. 0 %～115. 0 %之间,平均加标回收率为97. 3 % ,相对标准偏差为7. 54 %。取低浓度标准溶液(0. 10μg/ ml) 、中等浓度标准溶液(5. 0μg/ ml) 和高浓度标准溶液(10. 0μg/ ml) 各1ml ,分别取七份,分别按样品处理方法处理后进行测定,每个标准测定3 次并取平均值计算精密度,测得变异系数结果见表2。 2. 6 　方法检测限　进空白样,以基线3 倍噪声值在标准曲线查得结果计算,测得方法检出限为0. 01ng ,定量下限为0. 01ng ,按测定方法取样品量2g 计算,本方法最低检出量为0. 01μg/ g (即10ng/ g) 。 2. 7 　干扰试验　食品中常见成份淀粉、蔗糖、蛋白质、金属、非金属等共存物,在前处理阶段多已除去,因而对测定不会造成干扰；由于丙烯酰胺在酸性条件下易发生水解反应,导致测定结果偏低,因此pH 值对测定结果有一定影响,中性条件下测定结果稳定。食品样品pH多在近中性范围,测定实际样品时可不考虑样品pH 值的影响,对于加工过程中加有食醋等pH值较低的食物,处理前可用NaOH 等溶液调节至近中性,不影响测定；含油较多的食品样品,在提取前用正己烷预先提取一次以除去大部分油脂,可防止油脂的干扰。 3 　结论我国“十五”国家重大科技专项“食品安全关键技术”课题中有关建立食品中丙烯酰胺测定方法要求: 检测低限小于10ng/ g、回收率大于70 %、相对标准偏差小于20 %。本次所建立的食品中痕量丙烯酰胺的高效液相色谱分析方法操作简便、重现性好,而且方法精密度及检测限均符合痕量分析的要求,也满足了我国“十五”国家重大科技专项“食品安全关键技术”课题要求。

作者： 2007-5-18