藁本中2种主要活性成分的高效液相色谱定量分析方法研究

中药材质量的评价与控制是中药现代化研究及中药走向世界的关键问题之一，对中药材中与其功效主治相吻合的主要活性成分进行定量分析、评价药材质量是当务之急。我们课题组从1996年开始，一直从事中药材藁本的化学、药理学及有效成分的定量分析研究。力求找到与藁本功效主治相吻合的主要活性成分做为该药材的质量评价指标。经过药理研究表明，藁本中成分阿魏酸在大鼠体内对ADP诱导的血小板凝聚具有抑制作用，并具有明显镇痛及镇静作用， 藁本酚具有免疫抑制作用，因此首先建立了阿魏酸及藁本酚的定量分析方法^［1］，分析结果表明，19个产地的藁本均含有阿魏酸且含量较高，但藁本酚只在3个地道药材藁本中含有，因此藁本酚作为藁本药材质量评价的指标成分不具普遍性，文献报道藁本内酯具有解痉作用^［2］，故又建立了阿魏酸及藁本内酯的定量分析方法。
1　仪器与药品
　　HP 1100 DAD高效液相色谱仪。
　　甲醇：色谱纯，北京化工厂；乙腈：色谱纯，江苏淮阴塑料制品厂；水：二次重蒸水；磷酸：分析纯，吉林省军区化工厂。阿魏酸、藁本内酯标准品从植物辽藁本中提取分离得到，经光谱分析鉴定结构，经HPLC检测,含量均在98%以上。药材：中国藁本及辽藁本共19个产地的样品均经本所宋万志教授鉴定。
2　色谱条件
　　由于阿魏酸及藁本内酯极性相差较大，只有采取梯度洗脱方式才可同时测定这2种成分。通过对乙腈及水的梯度比例和水相的pH进行选择，确定乙腈-水（pH 4.0 ）二元梯度洗脱程序：
　　0.0～10.0 min　乙腈—水比例为(5∶95)～(70∶30)
　　10.0～25.0 min　乙腈—水比例为(70∶30)
　　检测波长：284 nm；色谱柱：4.6 mm×200 mm,固定相:Nucleosil-C₁₈(7 μm)。
3　线性关系
　　精密称取每种标准品3 mg ，分别置于1 mL容量瓶中, 用甲醇溶解并定容。精密吸取各标准品溶液10，20，40，80，160 μL分别置于1 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，得到2个标准品的5种不同浓度混合液。在上述“色谱条件”下进行分析，在0.12～2.4 μg之间各标准品的量与样品峰面积呈良好线性关系，结果见表1。 标准品进样相对标准偏差均在1%以内(n=5)。

　表1　标准曲线数据

4　提取方法
　　以河北承德市售辽藁本为样品, 比较了甲醇及甲醇-丙酮混合溶剂不同比例的提取效果, 结果甲醇提取效率最高而且完全, 又进一步试验了提取方法和时间, 精密称取样品粉末(过30目筛) 50 mg于10 mL刻度试管中，共4份，分别加甲醇5 mL，冷浸过夜后,分别超声10，20，30，40 min。进样量相同,比较峰面积。结果表明：冷浸过夜超声20min的方法提取效率最高。
5　回收率
　　以河北承德市售辽藁本为样品， 精密称取样品粉末 (过30目筛) 50 mg于10 mL刻度试管中，共4份， 其中2份加入混合标准品溶液，分别加甲醇5 mL，冷浸过夜，超声20 min，以3 500 r*min^-1离心， 取上清液经0.45 μm针式滤器过滤，取滤液4 mL浓缩蒸干。用少量甲醇溶解浓缩提取物并转移至1 mL容量瓶中， 再用少量甲醇多次洗涤蒸干用容器，合并洗液于前述容量瓶中，甲醇定容。按“色谱条件”进行分析，进样5 μL，计算峰面积， 结果见表2。

表2　2个化合物的回收率(n=2)

6　样品含量测定
　　按照前面所述方法测定19个产地样品中阿魏酸及藁本内酯的含量。结果见表3。液相色谱图见图1。

表3　不同产地中国藁本及辽藁本中2种成分的含量(%)

图1　标准品及不同产地藁本液相色谱图
A.标准品　B.河北承德产藁本　C.四川绵阳产藁本
1.阿魏酸　2.藁本内酯

7　讨论
　　从以上分析结果可以看出，19个产地的藁本样品中均含有阿魏酸和藁本内酯，而且含量较高，阿魏酸和藁本内酯的药理活性也与藁本主治风寒感冒、巅顶疼痛、风湿痹痛^［3］相吻合，因此我们认为这2种活性成分可以作为评价藁本药材的指标成分。

张金兰（中国医学科学院药物研究所　北京　100050）
谢凤指（中国医学科学院药物研究所　北京　100050）
李农（中国医学科学院药物研究所　北京　100050）
陈若云（中国医学科学院药物研究所　北京　100050）
周志华（中国医学科学院药物研究所　北京　100050）
周同惠（中国医学科学院药物研究所　北京　100050）