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【摘要】 目的：运用高效液相色谱法分析测定马齿苋提取物中α亚麻酸和亚油酸的含量，为马齿苋提取物的质量控制提供一种简单快捷的方法。 方法：根据以下色谱条件进行分析。色谱柱：Shimpack CLCODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；保护柱：DIKMA EasyGuard C18（10 mm×4.6 mm）；流动相：甲醇乙腈0.5%磷酸水溶液（60︰22︰18）；柱温：26 ℃；检测波长：210 nm；流速：1.1 ml/min；进样量：25 μl。结果：α亚麻酸的回归方程为A=2.915 8×107 C+12 250.9，r=0.999 9，线性范围为0.016 2～0.194 4 mg/ml，平均加样回收率为100.5%。亚油酸回归方程为A=1.366 4×107 C－9 759.39，r=0.999 9，线性范围为0.016 9～0.203 0 mg/ml，平均加样回收率为100.8%。结论：高效液相色谱法简单、准确、快速，可作为马齿苋提取物中α亚麻酸和亚油酸的定量分析方法。
【关键词】 马齿苋; 中草药提取物; α亚麻酸; 亚油酸; 色谱法, 高效液相
Objective: To determine αlinolenic acid and linoleic acid in extract of Portulaca oleracea L. by high performance liquid chromatography (HPLC).
Methods: The determination was done with a Shimpack CLCODS (250 mm×4.6 mm, 5 μm) and a DIKMA Easyguard C18 (10 mm×4.6 mm). Elution was employed with the mobile phase of methanolacetonitrile0.5% phosphonic acid (60︰22︰18) at flow rate of 1.1 ml/min. Column temperature was 26 ℃. Detection wavelength was 210 nm. Injection volume was 25 μl.
Results: The standard curves of αlinolenic acid and linoleic acid were linear in the range 0.016 2 to 0.194 4 mg/ml and 0.016 9 to 0.203 0 mg/ml, respectively. The regression equations were A=2.915 8×107 C+12 250.9, r=0.999 9 and A=1.366 4×107 C－9 759.39, r=0.999 9, respectively. The average recovery rates were 100.5 % and 100.8 %, respectively.
Conclusion: The present method (HPLC) may be considered to be reliable and simple for the determination of αlinolenic acid and linoleic acid in extract of Portulaca oleracea L.
Keywords: Portulaca oleracea L; plant extracts, Chinese; alphalinolenic acid; linoleic acid; chromatography, high performance liquid
马齿苋（Portulaca oleracea L.）为马齿苋科一年生肉质草本植物，具有清热解毒、散血消肿的功效。现代研究发现马齿苋除具有降血脂、松弛肌肉、抗菌、抗炎、镇痛以及促进伤口愈合等作用外，还具有较强的抗衰老和抗氧化作用［15］。我们的前期研究结果表明，马齿苋提取物有明显的抗缺氧和抗疲劳作用［6］。初步分析表明马齿苋提取物中含有大量不饱和脂肪酸成分，其中α亚麻酸可达10％以上。关于马齿苋提取物的质量控制研究，目前文献报道多采用衍生化气相色谱法和直接气相色谱法对α亚麻酸和亚油酸进行定量分析。但衍生化气相色谱法存在预处理繁琐以及不能实现对各游离脂肪酸准确定量的缺点；直接气相色谱法则存在基线稳定性差和色谱峰拖尾严重等不足，定量结果也不够理想，并且分析体系温度较高，易使α亚麻酸和亚油酸的双键断裂或双键异构化，影响定量结果的准确性。目前，已有运用高效液相色谱法（highperformance liquid chromatography, HPLC）测定人体中游离脂肪酸和植物油中游离脂肪酸的文献报道［79］，多采用C8、C18柱梯度洗脱，分析时间长，且样品往往需要柱前衍生化。目前尚无采用HPLC法对植物性样品中游离脂肪酸直接定量的报道。本研究采用HPLC和十八烷基键合相硅胶（octadecylsilyl silica gel, ODS）液相色谱柱C18柱等度洗脱，直接测定马齿苋提取物中游离脂肪酸的含量。研究结果显示该法简便、准确、快速、重现性好，为植物性样品中游离脂肪酸的定量分析提供了有益的借鉴。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪（LC20AD型，岛津国际贸易上海有限公司），配有四元梯度系统，二极管阵列检测器；分析天平（AUW220D型，岛津国际贸易上海有限公司）；超声波自动清洗器（DL720型，上海之信仪器有限公司)；乙腈、甲醇（色谱纯，DIKMA公司），水（高纯水，自制），正己烷、氯仿（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。
α亚麻酸（纯度为99.1%，Sigma公司，批号为096K1537），亚油酸（纯度为99.4 %，Sigma公司，批号为115K1141）；马齿苋提取物（采用醇提和离心工艺自制）。
1.2 实验方法
1.2.1 色谱条件 色谱柱：Shimpack CLCODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；保护柱：DIKMA EasyGuard C18（10 mm×4.6 mm）；流动相：甲醇乙腈0.5%磷酸水溶液（60∶22∶18）；柱温：26 ℃；检测波长：210 nm；流速：1.1 ml/min。
1.2.2 系统适应性实验 ODS为填充剂，理论塔板数按α亚麻酸和亚油酸峰面积计算，均不低于5 000，α亚麻酸和亚油酸与相邻色谱峰分离度均大于1.5，色谱峰拖尾因子均在0.95～1.05。α亚麻酸和亚油酸的保留时间（remaining time, tR）为tRα亚麻酸：27.86 min，tR亚油酸：42.32 min。空白溶液无干扰。
1.2.3 对照品溶液的制备 分别精密称定α亚麻酸、亚油酸各4.05、4.23 mg，置10 ml容量瓶中，以甲醇溶解，定容至刻度，得每毫升含α亚麻酸、亚油酸各0.405、0.423 mg的对照品液。
1.2.4 供试品溶液的制备 精密称定马齿苋提取物50 mg，置5 ml带塞容量瓶中，精密加入4 ml甲醇，密封，25 ℃超声处理（功率600 W，频率60 kHz）30 min，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
1.2.5 线性关系考察 分别吸取对照品溶液适量，将α亚麻酸依次稀释为0.194 4、0.162 0、0.129 6、0.081 0、0.032 4、0.016 2 mg/ml；亚油酸依次稀释为0.203 0、0.169 2、0.135 5、0.084 6、0.033 8、0.016 9 mg/ml，摇匀。将各对照品液分别进样25 μl，注入液相色谱仪，测定。
1.2.6 精密度实验 吸取α亚麻酸和亚油酸的混合对照品液25 μl，按1.2.1色谱条件连续进样6次，α亚麻酸和亚油酸峰面积相对标准差（relative standard deviation, RSD）分别为0.40%和0.59%。
1.2.7 重复性实验 准确称取同批样品，共6份，按供试品制备方法处理，分别测定α亚麻酸和亚油酸的含量。α亚麻酸的平均含量为1.10%，RSD=0.98％；亚油酸的平均含量为0.95%，RSD=1.18％。
1.2.8 稳定性实验 选取重复性实验样品溶液中的1份做稳定性实验，在1.2.1色谱条件下，精密吸取25 μl，分别于0、4、8、10、12、24 h进样测定，α亚麻酸、亚油酸峰面积的RSD分别为0.80％、0.40％，表明样品在24 h内稳定。
1.2.9 加样回收率实验 精密称取同批样品6份，置5 ml容量瓶中，分别准确加入混合对照品适量，按1.2.4处理，进样测定。
1.2.10 样品测定 分别取同批样品，共3份，分别置于5 ml容量瓶中，样品处理同前。精密吸取25 μl，注入液相色谱仪，测定，计算含量。
2 结 果
2.1 标准曲线 按照线性关系考察方法操作，以峰面积积分值（A）对浓度（C）进行线性回归，得回归方程。α亚麻酸：A=2.915 8×107 C+12 250.9，r=0.999 9（n=6），线性范围为0.016 2～0.194 4 mg/ml；亚油酸：A=1.366 4×107 C－9 759.39，r=0.999 9（n=6），线性范围为0.016 9～0.203 0 mg/ml。
2.2 回收率的测定 α亚麻酸的平均加样回收率为100.5%，RSD=1.06%（n=6）；亚油酸平均加样回收率为100.8%，RSD=0.66%（n=6）。见表1。表1 α亚麻酸和亚油酸回收率表2 样品中α亚麻酸和亚油酸含量
3 讨 论
目前，文献报道多采用柱前衍生化气相色谱法或柱前衍生化HPLC法进行脂肪酸的定量。为此，我们曾经尝试衍生化气相色谱法以及衍生化HPLC法，但由于存在样品预处理繁琐、分析时间长和影响因素多等缺点，检测的结果并不理想。
在前期研究中，我们采用气相色谱质谱联用方法，表明马齿苋提取物富含α亚麻酸和亚油酸等不饱和脂肪酸。由于α亚麻酸和亚油酸分子结构仅含有非共轭双键，只有末端吸收可用于定量检测。因此，对于流动相的选择而言，在保证良好分离度的前提下，应尽量降低流动相中甲醇的比例，提高乙腈所占的比例。同时，为避免基线的波动干扰，采用等度洗脱。对于该方法的专属性，本研究采用如下方法确证：（1）采用多个流动相条件，对照品和供试品峰保留时间一致；（2）相应色谱峰采用对照品添加法确认；（3）相应色谱峰进行纯度检测及紫外可见吸收光谱比对。本研究采用HPLC、ODS C18柱、等度洗脱和末端吸收检测法，直接测定马齿苋提取物中游离脂肪酸的含量，与已有方法比较，简便快捷，定量准确，为马齿苋提取物中α亚麻酸和亚油酸的定量分析提供了准确、快速、简便、实用的方法。
尽管采用HPLC、ODS C18柱进行马齿苋提取物中不饱和脂肪酸定量分析具有显著的优势，但是由于低极性的成分在反相填料表面的强吸附作用，用高浓度高洗脱能力溶剂（如乙腈）做流动相则可能会缩短色谱柱寿命，这些必须作为重要的因素加以考虑。目前看来，尽管这种因素仍然存在，但是由于HPLC设备普及率高，常规ODS C18成本越来越低，总体而言，方法的实用性较强，为植物性样品中不饱和脂肪酸的定量分析提供了一种准确、简便、快捷的方法。
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