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【摘要】 目的研究超高压水射流对黄柏提取液中盐酸小檗碱的影响。方法通过超高压150～350 MPa水射流处理黄柏醇提液，采用薄层色谱法定性鉴别和高效液相色谱法测定黄柏提取液中盐酸小檗碱及含量变化。结果不同超高压水射流处理黄柏提取液后，黄柏的薄层图谱中斑点个数、大小及Rf值无显著差异;高效液相色谱中峰个数及形状亦无明显差异，且经超高压150～350 MPa水射流处理后，黄柏中盐酸小檗碱的含量较黄柏原液均有不同程度的升高。结论该研究可为超高压水射流对中药有效成分的影响提供依据，为研究中药新的加工处理方法进行有益的探讨。
【关键词】 超高压水射流; 高效液相色谱法; 薄层色谱法; 黄柏; 盐酸小檗碱
超高压水射流技术是近几十年发展起来的一项新技术，它是指普通水经过超高压加压器，将水加压至100～400 MPa，然后通过一个直径约为0.2 mm左右的细小宝石喷嘴，产生600～1 000 m/s的水箭，可用来切割各种材料，也可对各种物体表面进行清洗，甚至用来食品灭菌，以达到食品保鲜的目的[1]。黄柏(Corter Phellodendri Chinensis)为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮，习称“川黄柏”，始载于《神农本草经》，列为上品，具有清热燥湿、泻火解毒、退虚热之功效[2]，现代药理学研究表明黄柏具有抗病原微生物、抗溃疡、降压、抗心律失常等作用[3]，临床应用十分广泛。盐酸小檗碱为黄柏的主要有效成分之一，与抗菌消炎作用密切相关[4]，可作为检测产品质量的主要指标之一，但小檗碱对热很不稳定，受热易破坏[5]，为探讨中药新的加工处理方法，提高中药的有效成分含量，本文用HPLC法测定黄柏醇提液经超高压水射流处理前后盐酸小檗碱的含量。现报道如下。
1 仪器、试剂与材料
LC-20AT高效液相色谱仪，包括LC-20AT泵、SPD-20A紫外检测器、AT-330柱温箱、Class-VP数据处理系统、7725i进样阀(日本岛津公司);DPSB-3040型超高压水射流系统(南京大地水刀股份有限公司)。
黄柏为市售，经本院王盛民教授鉴定为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮;盐酸小檗碱对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号：110713-200208);乙腈为HPLC级(美国Fisher公司);所用水为超纯水;其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备称取黄柏药材粗粉约500 g，精密称定，8倍量75%的乙醇回流提取3次，2 h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩，回收乙醇至无醇味，溶液定容至1 500 ml。量取黄柏提取液200 ml，用超纯水稀释至25 L，分别在150，200，250，300和350 MPa压力条件下，经超高压水射流处理，将各溶液摇匀、静置，分别取未经处理和各处理液的上清液过0.45 μm微孔滤膜，分别标号为0，1，2，3，4，5号，作为供试品溶液。
2.2 对照品溶液的制备精密称取在100℃干燥5 h的盐酸小檗碱对照品12.0 mg，置25 ml容量瓶中，加流动相溶解，稀释至刻度，摇匀;精密量取2 ml，置10 ml容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得(每毫升含盐酸小檗碱0.096 mg)。
2.3 丹参的薄层色谱鉴别照薄层色谱法实验，吸取“2.1”和“2.2”项制备的供试品溶液和对照品溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(10∶6∶1∶1)为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内展开，取出晾干，置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。斑点较为圆整，分离效果好，各供试品斑点大小及Rf值无显著差异。
2.4 HPLC色谱条件Symmetry R C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱(美国Waters);流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液-十二烷基(50∶50)(每100ml加十二烷基磺酸钠0.1 g);检测波长265 nm;流速1.0 ml·min-1;柱温30 ℃;进样量10 μl。在该色谱条件下，理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算不低于5 000，且样品中盐酸小檗碱与其他组分分离效果良好，对照品及样品的色谱图见图1。
a-盐酸小檗碱对照品 b-黄柏样品 Ⅰ. 盐酸小檗碱峰
图1 对照品及黄柏样品HPLC图
2.5 线性关系考察分别精密吸取“2.2”项下制备的盐酸小檗碱对照品溶液2，4，6，8，10 μl进样测定，记录各峰面积。以盐酸小檗碱进样量(μg)为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，得回归方程Y=982 667.66X-2 575.19，r=0.999 9(n=5)。结果表明盐酸小檗碱在0.192～0.960 μg范围内与峰面积有良好的线性关系。
2.6 精密度实验精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液10 μl，重复进样5次，测定峰面积，得RSD为0.73 %。
2.7 稳定性实验取“2.1”项未经超高压水射流处理的供试品溶液，同法分别于2，4，6，8，24 h测定，进样10 μl/次，结果RSD为1.82%，表明样品在24 h内稳定。
2.8 重复性实验取同一批样品粉末，按样品含量测定法同法测定5次，RSD为3.46%，表明该测定方法重复性比较好。
2.9 加样回收实验采用加样回收法，称取已知含量的黄柏药材5份，精密称定，再分别精密加入盐酸小檗碱对照品溶液 (0.40 mg·ml-1)20 ml，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样10 μl，记录色谱图，结果盐酸小檗碱平均回收率为95.1%，RSD为1.15%(n=5)。结果见表1。表1 盐酸小檗碱回收率实验
2.10 样品的测定精密吸取“2.1”项和“2.2”项下制备的供试品溶液和对照品溶液各10 μl分别进样5次，按上述色谱条件测定盐酸小檗碱含量。结果见表2。表2 样品测定结果
3 讨论
黄柏为常用中药，盐酸小檗碱为主要有效成分之一，其含量与黄柏的质量密切相关。小檗碱含量的测定方法有薄层扫描法[6]、紫外分光光度法[7]和高效液相色谱法[8]等。本文选用离子对高效液相色谱法测定盐酸小檗碱的含量，0.1%的十二烷基磺酸钠为反离子，能对待测成分起到改善良好的分离效果。
本实验以盐酸小檗碱为指标，测定经150～350 MPa不同压力水射流处理后的黄柏醇提取液。结果表明：黄柏提取液经超高压水射流处理后，盐酸小檗碱的含量均有不同程度的增加，以原液中盐酸小檗碱含量36.7 mg·g-1为100%计算，经150，200，250，300 MPa和350 MPa超高压力处理后的溶液中，盐酸小檗碱含量分别增加了2.30%，5.29%，6.39%，8.43%和0.58%。
在150～300 MPa超高压范围内，随着压力上升，盐酸小檗碱的含量依次升高，其原因可能是超高压力破坏了与小檗碱结合的非共价键(氢键、离子键、疏水键等)[9]，小檗碱游离出来，且随着压力的增加，破坏程度增大，游离的小檗碱也就增多，因此测得的盐酸小檗碱含量依次升高;也可能是与盐酸小檗碱结构相近的成分转化而来。
在350 Mpa超高压条件下，超高压处理前后盐酸小檗碱的含量无显著性差异，原因可能是在350 Mpa超高压处理后，处理液的温度迅速上升，由于游离态的小檗碱对热很不稳定，受热使部分小檗碱又分解为小檗红碱(Berbrrubine)，从而影响了处理液中盐酸小檗碱的含量。
黄柏提取液经超高压力水射流处理后，盐酸小檗碱含量增加，改善了黄柏其苦寒之性，增加了抗菌消炎作用;同时，超高压水射流对黄柏提取液中其它有效成分含量、药理作用的影响，有待于进一步深入研究和探讨。
【参考文献】
[1] 区 磊.超高压水射流技术的基本原理及应用[J].机电信息，2003，7：21.
[2] 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部[S].北京：化学工业出版社，2005：214.
[3] 王浴生，邓文龙.中药药理与应用[M].北京：人民卫生出版社，1998：895.
[4] 郭孝武.超声提高小檗碱得率的研究[J].西北大学学报，1999，29(6)：578.
[5] 魏 刚，黄月纯.盐酸小檗碱在中药制剂中的动态变化和含量分析[J].中国实验方剂学杂志，2000，6(4)：61.
[6] 刘龙先，杨 晔，张 园.黄柏软胶囊质量标准研究[J].中药材，2005，28 (7)：617.
[7] 桑 媛，张冬梅.黄柏胶囊中盐酸小檗碱含量的分光光度分析[J].中国药业， 2006，15 (5)：50.
[8] 代元英，陈永刚，肖学云.高效液相色谱法测定黄柏配方颗粒中盐酸小檗碱含量[J].山西医药杂志，2007，36 (3)：276.
[9] 王盛民.超高压水射流灭菌方法[P]，中国专利：CN1712071，2005-12-28.