脂氧合酶催化双高γ亚麻酸脂质过氧化产生的碳自由基的结构确证

【摘要】 采用液相色谱电子自旋共振波谱(LC/ESR)联用技术、液相色谱质谱(LC/MS)联用技术结合自旋捕集技术，研究了脂氧合酶(LOX)催化双高γ亚麻酸(DGLA)脂质过氧化过程中产生的碳自由基。以α[4吡啶基1氧]N叔丁基氮酮(POBN)为自旋捕集剂，在LOXDGLA反应混合物中与碳自由基形成自旋加合物后，根据各加合物在LC/UV/ESR和LC/MS中对应的保留时间，确定加合物的分子量，进一步根据加合物质谱裂解方式确定其结构。结果表明，在LOX催化DGLA脂质过氧化过程中产生的碳自由基主要包括·C7H13O2，·C10H17O2和·C5H11，分别来自DGLA脂氧自由基(8，11，15LO·)的β裂解。此结果有利于进一步研究DGLA在体内的脂质过氧化过程及该过程中产生的碳自由基的生理作用。

【关键词】  双高γ亚麻酸， 脂质过氧化， 自旋捕集， 液相色谱电子自旋共振波谱联用， 液相色谱质谱联用

　　1  引言
   
　　双高γ亚麻酸(DGLA, 20∶3, ω6)是人体中ω6多不饱和脂肪酸代谢的中间体［１］。亚油酸(LA, 18∶2, ω6)在Δ6去饱和酶作用下经脱氢形成γ亚麻酸(GLA, 18∶3, ω6)，GLA在延长酶的作用下产生DGLA。DGLA在Δ5去饱和酶作用下经脱氢可转化为花生四烯酸(AA, 20∶4, ω6)。DGLA、AA和二十碳五烯酸(EPA, 20∶5, ω3）是合成前列腺素(PG)和血栓烷的前体，其中由DGLA合成的PG1系列的化合物具有抗炎、抗血小板聚集［２］等功能。DGLA本身还具有抗高血压、抗过敏［３］等作用。
   
　　研究表明，GLA的一些作用，如抗过敏、对异位性湿疹和尿毒性搔痒症的治疗作用等［４，５］，可能是通过其代谢物，即DGLA和PG1而发挥的。体外细胞实验表明，DGLA可以减少脂多糖刺激下炎症因子的释放［６］。脂氧合酶(LOX)催化DGLA反应产生的15羟基二十碳三烯酸能降低前列腺癌变的风险［７］。这些作用可能与DGLA的脂质过氧化有关。脂质过氧化是由自由基介导的链式反应，该过程中产生的自由基在许多疾病进程中具有重要作用。由于分析方法的限制，对DGLA脂质过氧化过程中产生自由基的研究还未见报道。为进一步研究LOX催化DGLA脂质过氧化过程中产生的自由基的生理作用，首先需确认该反应中产生了何种自由基。
   
　　本研究采用自旋捕集技术，以α[4吡啶基1氧]N叔丁基氮酮(POBN)为捕集剂，反应过程中与碳自由基形成自旋加合物，延长了碳自由基的寿命。然后采用液相色谱电子自旋共振波谱(LC/ESR)、液相色谱质谱(LC/MS)联用技术，分离并鉴定了LOX催化DGLA脂质过氧化过程中产生的碳自由基。结果表明，该反应中产生的碳自由基主要包括·C7H13O2， ·C5H11和·C10H17O2，分别来自DGLA脂氧自由基(8，11，15LO·)的β裂解。本方法的建立有利于进一步研究DGLA的脂质过氧化过程及该过程中产生的碳自由基的生理作用。

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂
   
　　1200液相色谱系统、6300离子阱质谱仪(Agilent公司)；Bruker EMX 电子自旋共振波谱仪(Bruker公司)，恒温振荡器(Boekel公司)；Beckman MicrofugeR 22R离心机(Beckman公司)，VacufugeTM 5301真空浓缩机(Eppendorf公司)。
   
　　无水乙醇、冰醋酸、大豆脂氧合酶(LOX, Type IB)购自Sigma公司；DGLA（Cayman公司）；高纯度α[4吡啶基1氧]N叔丁基氮酮(POBN，Alexis Biochemicals公司)；氘代ＰＯＢＮ(D9POBN， CDN Isotopes公司)；Chelex 100(200～400目，钠型，BioRad 公司)；乙腈(HPLC 级，Mallinckrodt Baker公司) 和 水(LCMS级， MD Chemicals公司)。

　　2.2  反应条件
   
　　LOX催化DGLA的脂质过氧化反应在磷酸盐缓冲液(50 mmol/L，pH 7.5)中进行，磷酸盐缓冲液中的金属离子用Chelex 100树脂去除［８］。将含20 mmol/L POBN、 2×104 U/mL POBN及磷酸缓冲液的混合物经恒温振荡(37 ℃， 400 r/min)混匀后，加入DGLA 1 mmol/L开始反应。反应液总体积为200 μL，其中含1％乙醇(V/V, 用于溶解DGLA)。在37 ℃、400 r/min条件下反应30 min后，加入等体积的乙腈停止反应并沉淀LOX［９］。混合物离心除去LOX，取上清液浓缩挥发去除乙腈，浓缩液即可进样分析。

　　2.3  电子自旋共振波谱扫描条件
   
　　反应进行30 min后，即可对反应液作ESR扫描，或与乙腈混合后再扫描。在室温下，固定频率在9.78 GHz扫场获得ESR光谱图。其它参数设置为: 磁场中心位置3494.4 G；扫描宽度70 G；调制频率100 kHz; 微波功率20 mＷ；调制幅度1.0 G; 接收机增益5.0×104; 时间常数 0.655 s；转换时间 0.164 s。
   
　　2.4  液相色谱电子自旋共振波谱条件
   
　　Zorbax EclipseXDB C18 色谱柱(75 mm×3.0 mm, 3.5 μm)。流动相A为水(0.1％冰醋酸)， B为乙腈(0.1％冰醋酸)。梯度洗脱， 0～40 min， 100％～30％ A。流速0.8 mL/min，进样量40 μL。紫外检测波长265 nm［１０］。
   
　　在线ESR检测采用高灵敏Aquax检测池，将磁场固定在POBN自由基加合物ESR光谱的第一个峰处，进行时间扫描。扫描参数：调制频率100 kHz; 微波功率 20 mW；调制幅度3.0 G; 接收机增益4.0×105; 时间常数 2.6 s。

　　2.5  液相色谱质谱条件
   
　　液相色谱条件与LC/ESR相同。将UV检测器出口通过三通与MS相连并用三通调整进入离子源的流量为30～40 μL/min。离子源为ESI，正离子监测模式。毛细管传输电压－4.5 kV，喷雾压力0.14 MPa，干燥气为N2，流量8 L/min，干燥温度60 ℃，化合物稳定性20％，扫描数50。扫描范围m/z 100～600。LC/MS分析后，对可能的化合物m/z采用选择离子色谱图(EIC)与LC/ESR色谱图对比的方法进行辨认，提取宽度为m/z ±0.5 Da。采用MRM模式对可能的目标化合物进行LC/MS2分析，LC/MS2中除扫描数设为5以外，其余参数与LC/MS相同。当POBN自由基加合物的LC/MS和LC/MS2数据不足以确定其形成及结构时，可采用相同量D9POBN代替POBN反应的方法进一步确证，反应条件同2.2节。

　　3  结果与讨论

　　3.1  POBNLOXDGLA反应体系电子自旋共振波谱（ESR）分析
   
　　ESR是检测自由基的唯一仪器分析方法。对寿命极短的自由基，常采用自旋捕集技术，即使其与某种化合物(称为自旋捕集剂)反应，生成相对稳定的自由基加合物后再用ESR检测。本实验中使用的POBN能够有效捕集反应过程中产生的碳自由基。在有POBN存在时，对LOX催化DGLA的脂质过氧化反应溶液进行ESR扫描，其波谱见图1a，为POBN自由基加合物的6个特征峰，来自POBN结构中与单电子相邻的磁性核N和H引起的超精细分裂(耦合常数aN≈15.69 G， aH≈2.68 G)。对照实验中，在不加POBN或不加LOX时，均没有自由基信号(图1 b和c)；而不加DGLA时(以相同量乙醇代替)，有很小的自由基信号，该信号来自乙醇氧化产生的羟基乙基自由基(图1d，aN≈15.71 G， aH≈2.62 G)［11］。由图1可看出，加入POBN后即可用ESR检测到该体系产生的碳自由基加合物的信号，且自由基主要来自LOX催化的DGLA过氧化反应，但仅有ESR波谱不能给出单个自由基的结构信息。

　　3.2  液相色谱电子自旋共振波谱、液相色谱质谱及二级质谱分析
   
　　POBN与不同的碳自由基形成加合物时，由于自由基部分(·R)结构不同，其色谱保留时间也不相同。为确定LOXDGLA反应体系中产生何种自由基，对图1a中的样品经处理后进行LC/UV/ESR和LC/MS分析。由于脂质过氧化反应非常复杂，很难从UV色谱图中找到自由基(图2a)，而采用ESR检测时只有自由基有响应(见图2b)，共有5个自由基色谱峰。其中色谱峰1和2在UV色谱图中被POBN掩盖; 色谱峰3～5在UV中均可找到相对应的色谱峰(图2 a和b)。比较UV色谱图和 LC/MS总离子流色谱图，可确定相应的色谱峰位置(图2c)。
     
　　图1  LOX催化DGLA脂质过氧化反应溶液和对照实验的ESR波谱图（略）

　　Fig.1  Offline ESR spectra of lipoxygenase(LOX)catalyzed dihomoγlinolenic acid(DGLA) reaction system and relevant control experiments

　　a. LOX/DGLA/POBN反应混合物(LOX/DGLA/α［４pyridyl1oxideNtertbutyl nitrone］(POBN) reaction mixture); b. 无POBN对照实验(Without POBN control); c. 无LOX对照实验(Without LOX control); d. 无DGLA对照实验(Without DGLA control)。 

　　图2  LOX/DGLA/POBN反应体系的LC/UV(a), LC/ESR(b)色谱图和LC/MS总离子流色谱图(c)（略）

　　Fig.2  LC/UV(a), LC/ESR(b) chromatogram and LC/MS total ion current chromatogram(c) of LOX/DGLA/POBN reaction mixture

　　*： 表示与ESR色谱峰对应的UV和MS色谱峰(Marked UV and MS peaks corresponding to ESRactive peaks)。

　　为进一步确定LC/ESR各色谱峰化合物的结构，本实验利用LC/MS的选择离子色谱图(EIC)与LC/ESR对照，并结合DGLA可能的脂质过氧化反应机理(见图解1)，对图2b中的ESR色谱峰进行辨认，再用LC/MS2的裂解方式确证其结构。按照该方法，确认图2b中色谱峰3(tR=9.3 min)为乙醇氧化产生的羟基乙基自由基(·CH(OH)CH3)的POBN加合物。由于本实验以乙醇为溶剂，而乙醇也能够被氧化生成·CH(OH)CH3，其POBN加合物的m/z 为240。该自由基与DGLA无关，其LC/MS2质谱裂解方式与文献［９，１１～１３］的结果一致，证明其结构为POBN/·CH(OH)CH3。
   
　　图解１  LOX催化DGLA脂质过氧化过程中产生POBN碳自由基加合物的反应机理（略）

　　同理，可确认LC/ESR色谱峰4(图2b，tR=15.9 min)为8LO·的β裂解产生的·C7H13O2的POBN加合物，其m/z为324(图解１)。m/z 324的EIC中色谱峰保留时间与LC/ESR色谱峰4一致(图３a，图2b)，其质谱裂解方式证明了其结构为POBN/·C7H13O2(图３b, 图解１)。LC/ESR色谱峰5(图2b，tR=20.9 min) 为15LO·的β裂解产生的·C5H11的POBN加合物，其m/z为266(图解1)。m/z 266的EIC中色谱峰保留时间与LC/ESR色谱峰5一致(图３c，图2b)，其质谱裂解方式证明了其结构为POBN/·C5H11(图３d, 图解１)，并与文献［９，１１］的结果一致[12,14]。
   
　　图3  m/z 324和m/z 266的选择离子色谱图及相应的LC/MS2质谱图（略）

　　a，b. m/z 324的选择离子色谱图和LC/MS2质谱图(EIC of m/z 324 and its MS spectrum); c，d. m/z 266的选择离子色谱图和LC/MS2质谱图(EIC of m/z 266 and its MS spectrum)。

　　此外，DGLA的11LO·的β裂解也可能产生自由基，其加合物POBN/C10H17O2的m/z 为364(图解１)。当提取m/z 364的EIC时，色谱峰的保留时间几乎与m/z 266重叠(图４a，图2b)。为确定反应中形成了m/z 364加合物，用同样浓度的D9POBN(用氘取代POBN叔丁基上的9个氢，图解１)替换POBN作为自旋捕集剂，则POBN/D9POBN加合物的分子量相差9 Da［１４］。在相同色谱条件下D9POBN体系中m/z 373的EIC见图４c，与图４a比较可确定POBN/·C10H17O2的产生，并且有3个异构体(tR=19.6, 20.9, 21.3 min)。由于D9POBN的极性及分子体积略大使D9POBN加合物的保留时间略小于POBN加合物(图４a, ４c)。LC/MS2分析表明POBN/·C10H17O2和D9POBN/·C10H17O2具有相同的裂解方式(图４b、d， POBN加合物的a, b, c对应D9POBN加合物的a′, b′, c′)，证明了其结构。LC/MS2分析显示3个异构体具有相同的质谱图，因而MS数据不能区分异构体。
 
　　图４  POBN/LOX/DGLA体系中m/z 364和D9POBN/LOX/DGLA体系中m/z 373的选择离子色谱图及相应的LC/MS2质谱图（略）

　　a，b. m/z 364的选择离子色谱图和LC/MS2质谱图(EIC of m/z 364 and its MS spectrum); c，d. m/z 373的选择离子色谱图和LC/MS2质谱图(EIC of m/z 373 and its MS spectrum)。

　　3.3  LOX/DGLA产生碳自由基的机理及本方法的意义
   
　　LOX催化多不饱和脂肪酸的过氧化反应为自由基介导的链式反应。由以上研究结果可知，LOXDGLA反应中产生的碳自由基主要来自DGLA脂氧自由基的β裂解(图解１)。结合以前的研究结果[９，１１,1２]，推测LC/ESR色谱峰1和2(图2b，tR≈7.1～7.4 min)可能为·L(OH)2的POBN加合物，但由于被大量的POBN掩盖而难以获得较好的质谱数据。反应中还有两种碳自由基未检测到，即DGLA脂自由基(L·）和DGLA脂氧自由基重排后的碳自由基(·LO)(图3)，可能是由于缓冲液的pH值较低，使以上两种自由基不稳定，不利于POBN捕集所致。
   
　　LC/ESR和LC/MS联用克服了ESR只能给出总自由基信号的缺点，可用于研究单个自由基。D9POBN(与POBN分子量差9 Da)的应用使自由基加合物的结构确证更有说服力，例如POBN/·C10H17O2的确证(图４)。LC/MS的选择离子色谱图(EIC)能弥补LC不能完全分离组分的缺点，例如POBN/·C10H17O2和POBN/·C5H11虽然保留时间相同，EIC却互不干扰(m/z不同)，有利于复杂样品的分析。
   
　　多不饱和脂肪酸的脂质过氧化过程非常复杂，产物多，包括脂质过氧化物、自由基、醛、酮等一系列生理活性物质。其中自由基由于非常活泼，易与其它分子发生反应，例如可直接与蛋白质、核酸反应，从而改变它们的功能。研究表明，自由基与许多疾病的发生发展有关，建立自由基分析方法有助于研究自由基与疾病之间的关系。本研究中采用LC/ESR、LC/MS和自旋捕集技术，鉴定了LOXDGLA反应中产生的碳自由基。本方法的建立及研究结果有利于深入研究DGLA本身及其衍生的自由基的生理作用。

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