国内外不同厂家色谱柱对人胰岛素注射液分离效果的考察

　　摘要　目的：比较国内外不同厂家色谱柱对人胰岛素注射液的分离效果。方法：以不同配比的硫酸盐缓冲液和50 %乙腈溶液为流动相，检测波长为214 nm。结果与结论：通过调整流动相的不同配比，国内外不同厂家色谱柱均可使人胰岛素与脱酰胺胰岛素及防腐剂得到良好分离。

Suggestion and Evaluation of Chromatographic Columnsfrom Different Domestic and Foreign Manufacturers for the Separation of Human Insulin Injection by HPLC

Zhang Ying and Chen Xiaoxia
(Tianjin Institute for Drug Control,300070)

　　Abstract　Objective：We make a comparision of columns between domestic and Vydae for separation of human insulin injection by HPLC.Method:The mobile phase is sodium sulfate buffer(pH 2.3)-50 % acetonitrile (45∶55) or (47∶53).Detection wavelength is 214 nm.Result and Conclusion:It has been shown that columns from different domestic and foreign manufacturers could be successfully applied to separate human insulin and its antiseptic by HPLC after appropriately adjusting the proportion of the same mobile phase.
　　Key words　human insulin injection,HPLC,chromatographic column

　　基因重组人胰岛素自80年代研制成功以来，正在世界范围内逐步取代动物提取的胰岛素，其含量测定方法也由小鼠血糖法逐步被HPLC法所代替^［1，2］。目前美、英、日及丹麦等国均用美国Vydae公司的ODS柱做人胰岛素含量测定，但该柱价格是国内ODS柱的8～10倍。本工作对国内的ODS柱是否可用于人胰岛素分析进行了考察，现报道如下：
1　仪器与试剂
岛津LC－10A HPLC，COMPA DESKP-
RO XL 4/66计算机，HP DESKJET 505打印机；日立L－6200 HPLC，C－RIA数据积分仪。
对照品及样品均由丹麦诺和诺德公司(Novo Nordisk)提供。脱酰胺胰岛素纯度为99.6 %。乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。
2　色谱条件
色谱柱：美国Vydac protein & peptide C₁₈柱(粒度5 μm)；天津特纳公司Kromasil ODS柱(5 μm)；大连依利特公司Hypersil ODS柱(5 μm)；天津试剂二厂YWG－C₁₈柱(10 μm)，各柱的内径及柱长均为(4.6 mm×250 mm)。
流动相的配制：取硫酸钠(Na₂SO₄^.10H₂O)64.66 g，置1000 mL量瓶中，加水约300 mL，加磷酸(85 %以上)2.4 mL，加水至900 mL，用磷酸调pH为2.3，加水至刻度，过滤，脱气，加乙醇胺0.3 mL，即得硫酸盐缓冲液。流动相a为硫酸盐缓冲液-50 %乙腈水溶液(45∶55)，流动相b为硫酸盐缓冲液-50 % 乙腈水溶液(47∶53)。使用前用0.45 μm微孔滤膜滤过及脱气。流速：1.0 mL^.mm^-1；柱温：40 ℃；衰减：2；测定波长：214 nm；进样量：20 μL。
3　实验方法与结果
3.1　测定溶液的制备
对照品溶液的制备：取对照品溶液(100 U^.mL^-1)1支，加6 mol^.L^-1盐酸40 μL，充分振摇溶解。
脱酰胺胰岛素溶液的配制：取脱酰胺胰岛素10 mg制成40 μg^.mL^-1的溶液。
供试品溶液的制备：澄清型注射液可直接供分析，混悬型注射液按每1 mL加入6 mol^.L^-1盐酸4 μL使溶解后供分析。
3.2　在Vydac ODS柱上分离　用流动相a时，胰岛素与2种防腐剂在8 min内基本分离，但未见分离出脱酰胺胰岛素。改用流动相b时，在16 min内可使胰岛素与2种防腐剂及脱酰胺胰岛素获得基线分离(图1)。澄清型样品的色谱图和混悬型样品的色谱图一致。

图1　在Vydac柱上混悬型样品的色谱图
A.流动相a　　　B.流动相b
1.苯酚　2.间甲酚　3.胰岛素　4.脱酰胺胰岛素

3.3　在YWG－C₁₈柱上分离　YWG－C₁₈柱系无定形填料及自行填充的色谱柱，当用流动相a时第二个防腐剂的峰与胰岛素峰的分离度小于1.5；用流动相b时，在20 min即可得到良好分离(图2)并可分离出脱酰胺胰岛素，对称性及分离度均符合药典要求。澄清型样品的色谱图同混悬型样品色谱图。

3.4　在天津特纳公司Kromasil ODS柱上的分离　该ODS柱用流动相a时约26 min得到分离(图3)，峰的对称因子及分离度符合要求。但经调整流动相配比未能分离出样品中脱酰胺胰岛素及加入供试液中的脱酰胺胰岛素对照品。澄清型样品色谱图与混悬型样品色谱图一致。
3.5　在Hypersil ODS柱上的分离　用流动相a时在13 min内得到良好分离，峰的对称性及分离度符合要求，用流动相b时在23min分离出脱酰胺胰岛素(图4)。澄清型样品色谱图与混悬型样品色谱图一致。

4　讨论
4.1　通过适当调整流动相比例，国内YWG－C₁₈柱与Hypersil ODS柱均能完成人胰岛素注射液的分离，尤其是大连依利特公司的Hypersil ODS柱性能与Vydac ODS柱基本相近。因此，国产YWG－C₁₈柱与Hypersil ODS柱可替代Vydac柱使用。
4.2　根据经验，配制流动相时，先将缓冲液与乙腈水溶液混合后抽滤，然后加入乙醇胺，否则由于在抽滤中乙醇胺损失而延长人胰岛素的保留时间。

*　日本JICA专家
作者单位：张　莹　陈晓霞　柴崎利雄^*　天津市药品检验所　300070
本文于1997年8月25日收到

参考文献
1　USP.Ⅹ　Ⅹ　Ⅲ.807
2　BP.1993.355