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摘要：目的 建立金银花中绿原酸的色谱分离纯化方法．方法采 用亲脂性吸附树脂与葡聚糖凝胶色谱纯化技术，将其水提物经亲脂性吸附树脂柱色谱预分离后，0.1mol/L-1盐酸调节pH到4.0左右，葡聚糖凝胶sephadexLH-20精制纯化，洗脱溶剂为5O%丙酮水溶液．结果产品经MS、红外、紫外和HPLC图谱鉴定，并与对照品比较对照，结果显示所得的绿原酸纯度>98％．结论该方法简单，重复性较好，可用于绿原酸单体成分的制备．
关键词：绿原酸；金银花；分离纯化；聚酰胺；葡聚糖凝胶
0 前言
绿原酸(Chlorogenic acid，化学名3-0-caffeoylquinic acid)，是由咖啡酸和奎宁酸组成的缩酚酸，属于苯丙素类化合物，广泛分布忍冬科、蔷薇科、菊科、茜草科合杜仲科等植物中，是杜仲、金银花等传统中药清热解毒、消炎抗菌的主要药效成分．
绿原酸的分布、提取和生物活性已有相关的报道．目前已有的提取分离方法有β-CD包合、无机盐沉淀、酶法和制备型高效液相色谱法等，刘世名等采用polyamideSC-6分离纯化、LC-MS联用技术鉴定牛蒡叶中的绿原酸．已有的方法存在分离步骤繁琐、工艺复杂、设备成本过高等不足，最终产品不能作为对照品使用．本文提出一种聚酰胺前处理结合sephadex LH-20凝胶色谱纯化金银花中绿原酸的方法，得到的产品纯度大于98%．该法稳定、快速、高效，解决了新药开发中绿原酸对照品的制备问题．
1 实验部分
1．1 仪器与试剂
Waters高效液相色谱仪，包括：2487紫外-可见光分光光度检测器，515液相色谱泵，Rheodyne7725i型手动进样器，Millennium 2010软件．蠕动泵，自动馏分收集器．Agilent1100 HPLC MS联用仪．
金银花药材(其中绿原酸的含量为3%)由同仁堂药店提供，对照品(纯度大于98%)由中国药品生物检定所提供．
甲醇(色谱纯)、乙醇、丙酮、冰醋酸、盐酸和氢氧化钠(分析纯)，流动相和溶液配制均使用石英亚沸蒸馏器的二次蒸馏水．
1．2 色谱分析条件
色谱柱为symmetry RP18柱(150mm ×3.9mm i．d．、5μm )，流动相为甲醇-水(40：60)，含1%(V／V)冰醋酸；流速为1.0 mL/min；检测波长325nm；进样体积2OμL．
1．3 实验方法
1．3．1 检测方法的建立
1)标准品溶液的制备精确称取绿原酸对照品2.4mg置于50mg量瓶中，加入流动相溶解并稀释到刻度，摇匀，得每1mL含0.048mg的对照品溶液．
2)线性关系考察精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL，分别置于10mL量瓶中，加入流动相稀释至刻度．精密吸取上述对照品溶液2OμL，注入色谱仪，测得色谱峰面积．以进样量C(μg)对峰面积A进行线性回归（n=5），得回归方程A=3025147C一587329(r=0.998)．结果表明，绿原酸在进样量0.096～0.48 μg范围内呈良好的线性关系．
3)精密度试验对照品和样品溶液各2OμL，按色谱条件分别重复进样1O次(每次20μL)，测定色谱峰面积，其相对标准偏差RSD分别为0.9 0／0和1.7%。
4)稳定性试验 精密吸取对照品溶液2OμL，分别于0、2、4、6、8、10、12h注入色谱仪，按色谱条件测得色谱峰面积·其RSD为1.5 %．同时对样品重复上述试验，RSD为2.3%，表明对照品和供试品在12h之内稳定．
5)重复性试验在同日内和不同日期，取同一批样品，分别由不同操作者，制备供试品溶液，测定绿原酸的含量5次，其日内RSD为1.8%，日间的RSD为2.9%，表明重复性好．
1．3．2 pH稳定性试验
用0.1mol/L 的盐酸或氢氧化钠溶液调节绿原酸提取液的pH至3～8之间，盛于棕色瓶中，4℃冰箱中待测．
1．3．3 样品分离纯化
第一次采用95%乙醇、后两次采用5O%的乙醇水溶液，固液比均为1：1O，调节溶液的pH约为3，5O℃左右提取3次．合并提取液，浓缩至无醇味，4℃ 冰箱冷藏过夜，抽滤得上清液，待用．酸、碱、醇处理好的聚酰胺树脂装于玻璃柱(400×10mm)中，缓慢加入上步上清液至流出液变浑浊，依次用水、10%、2O%、3O%、4O%和5O%乙醇水溶液(盐酸调节pH至4.0左右)梯度洗脱，HPLC检测合并绿原酸含量大于6O%的洗脱液，浓缩后置于0℃冰箱中析晶，抽滤．上述晶体溶于适量水中，加于SephadexLH-20柱柱顶．层析条件为洗脱剂5O%的丙酮水溶液(pH-4)、流速0.5mL/min．自动馏分收集器收集，HPLC检测，合并绿原酸洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥得绿原酸纯品．
2 结果与讨论
2．1 HPLC条件和检测方法
HPLC为常用的定性定量分析方法．由于绿原酸溶于水后有部分解离，导致检测色谱峰拖尾和分析结果重现性差等问题，因此有必要在流动相中添加酸性物质，抑制绿原酸的解离．检测方法实验证明1的冰醋酸改性的流动相可以有效的分析绿原酸成分．
2．2 pH稳定性分析
文献报道[8]，光照或加热条件导致绿原酸的分解．其原因可能为绿原酸结构中的羧酸基团或邻二酚羟基易于发生反应．HPLC检测结果显示，绿原酸提取液的pH值处于3-5时，绿原酸比较稳定．表明在这种情况下绿原酸的含量不随时间的变化而降低．
2．3 聚酰胺树脂的梯度洗脱分离
在各个梯度乙醇洗脱液中，绿原酸集中出现在3O%乙醇的洗脱液中．为了增加绿原酸与提取液中其他杂质成分的分离度，结合稳定性实验，用盐酸溶液调节洗脱液的pH至4左右．
推测在这种情况下，绿原酸分子处于未解离状态，吸附在聚酰胺树脂的表面，2O%及其以下的乙醇水洗脱液中不含有绿原酸成分，3O%的乙醇水溶液可以洗脱，同时杂质含量明显降低，绿原酸的纯度大于6O%，此时的回收率大于7O%．
2．4 sephadex LH-20纯化
经预实验分析，选择pH(3、4和5)，洗脱剂(50%甲醇水、5O%乙醇水和5O%丙酮水)，流速(O.5mL/min、1.0 mL/min和1.5mL/min做如下正交实验．
经过SPSS统计软件分析，最优的分离条件为：pH为4、洗脱剂为5O%的丙酮水溶液和流速0.5mL/min．经过一次sephadex LH-2O分离，得到纯度98%以上的绿原酸108mg．
2．5 结构鉴定
纯化得到的白色针晶，HPLC测定为一单峰，nm：329.7.IR/cm：3362(-OH)、1726(C=O)、1687、1640、1601、1289、1191、969、818．ESI／MS m/z：377.2[M+Na]+，353.2[M-H]-，与标准品比较结果一致．推断该化合物确为绿原酸．
参考文献
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来源：东方医药网