摘要：采用毛细管电泳．电化学检测法(CE-ED)同时测定了蜘蛛香根中香叶木素、山奈酚、芹菜素、绿原酸和咖啡酸等5种主要生物活性成分的含量，考察了运行缓冲液酸度、浓度、分离电压、氧化电位和进样时间等实验参数对分离、检测的影响。在最佳实验条件下，以直径300 皿的碳圆盘电极为工作电极，检测电位为+950mV(vs．SCE)，在50mmol／L的硼砂缓冲溶液(pH 9.23)中，上述各组分在23min内能完全分离。5种组分在两个数量级的范围内呈良好线性关系，检测下限(S／N=3)达1.7×0.0001～1.8×0.00001g／mL。该法已成功地应用于蜘蛛香根中活性成分的分离检测，结果令人满意。
关键词：毛细管电泳，电化学检测，蜘蛛香，多元酚
1 引 言
蜘蛛香(Valeriana jatamansi Jones)又名马蹄香、老虎七、印度缬草等，系败酱科缬草属植物，主产于四川、贵州等地。其人药部分一般为干燥根茎，具有镇静安神、理气止痛、祛风除湿、消炎止泻等功效，可用于治疗脘腹涨痛，消化不良，腹泻，痢疾，风湿痹痛，腰膝酸软等病症。对其化学成分进行的大量研究发现，环烯醚萜类、黄酮类和酚酸类化合物是其主要的生物化学成分。现代药理实验表明，黄酮类化合物能预防
癌症，咖啡酸和绿原酸等酚酸类物质则具有抗氧化性、抗诱变性和抗癌活性。
目前，蜘蛛香中挥发性成分、脂肪酸和萜类化合物等成分的检测，主要有薄层扫描法、GC-MS、高效液相色谱法 和气相层析-质谱联用等方法。毛细管电泳(CE)具有分离效率高、分析速度快、重现性好、样品和试剂用量少等优点，是一种高效的分离分析技术。与电化学检测方法联用，CE-ED对电活性物质具有很高的灵敏度和选择性。本研究首次采用CE-ED，分别测定了不同产地蜘蛛香根中香叶木素、山奈酚、芹菜素、绿原酸以及咖啡酸等5种多元酚类化合物，建立了一种分离检测蜘蛛香根中活性成分的简便、可靠、灵敏的新方法。
2 实验部分
2．1 仪器
毛细管电泳电化学检测系统(CE-ED)为自组装。包括±30 kV高压电源(中国科学院上海应用物理研究所)；BAS LC-4C安培检测器(美国生物分析系统公司)；EB100型台式单笔记录仪(上海大华仪表厂)；Model 14901三维微定位器(斯特拉特福，美国康涅狄格州)；75 cm长熔融石英毛细管(内径25μm，外径360μm，河北永年锐沣色谱器件有限公司)；毛细管、检测池和三电极体系均组装在一个带有微动开关的树脂玻璃框架中，以保证仪器和操作人员的安全。当框架打开时，微动开关会自动切断电源。工作电极为300μm的碳圆盘电极，使用前先用金相砂纸抛光，并置于二次蒸馏水中超声清洗5min，然后借助三维微定位器，使工作电极与毛细管
出口在一条直线上，并尽可能靠近毛细管的末端。铂丝为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极。用BAS LC-4C安培检测器检测氧化电流，电泳图谱由单笔记录仪记录。采用电迁移进样，使用16kV电压从毛细管阳极端进样8s，检测池为阴极电泳池。
2．2 试剂
山奈酚、芹菜素、绿原酸和咖啡酸标准品购自Sigma公司；香叶木素购自中国药品生物制品检定所。5种标准储备液浓度均为1.00X0.001g／mL，用无水乙醇(分析纯)配置，避光4℃保存。其它不同浓度的工作液，用运行缓冲液(pH值8.7～9.5，浓度为50.0mmot／L的硼砂溶液)稀释得到。所有分析样品均经0.22μm聚丙烯滤膜过滤后进样。四川蜘蛛香根由第二军医大学
药学院提供，贵州蜘蛛香根购自贵阳市药店。
2．3 试液的配制
将两种产地蜘蛛香的根磨成粉状，分别准确称取2.0g，用10mL、80％乙醇溶液：去离子水=4：1(V/V)超声萃取1h后，先用滤纸过滤，再用0.22μm聚丙烯滤膜过滤，将得到的滤液放于阴暗处保存。
3 结果与讨论
3．1 电泳条件的选择
3．1．1 工作电极电位的影响 电化学检测是基于被测物质能够在碳电极上发生电化学氧化的性质。上述5种组分由于带有酚羟基，均具有较好的电化学活性，且电极电位直接影响被分析物的电化学响应，因此为了选择最佳工作电位，对5种组分的流体伏安曲线进行了测定。当电极电位超过+500mV(vs．SCE)时，5种组分均产生氧化电流。随着电极电位的增大，香叶木素和芹菜素的氧化电流增加迅速，而其它3组分的响应受氧化电位影响较小。当电极电位大于+950mV时，虽然香叶木素和芹菜素的氧化电流仍稍有增加，但此时本底电流大幅增加，噪音明显提高，而导致基流不稳。所以选择检测电位为+950mV(vs．SCE)，此时信噪比较高，电极的稳定性好。
3．1．2 运行缓冲液酸度和浓度的影响 在碱性溶液中，硼酸盐能与待测物螯合生成配位阴离子来增加溶解度，减少了因吸附造成的峰拖尾等影响，所以选用硼砂作为缓冲体系。如图2所示，在pH 8.7～9.5范围内5种组分随着pH值的提高，迁移时间明显延长，且pH值为9.2～9.5时，5组分可实现基线分离。当pH值低于9.00时，绿原酸与山奈酚不能实现分离，而pH值过高会导致待测物被氧化。故选择缓冲溶液的酸度为pH 9.23。此时被测物可以完全分开，且分析时间较短。
毛细管内壁的zeta电位与运行缓冲液的pH值和浓度或离子强度有关。在固定的pH值下，有效zeta电位随着缓冲液浓度的增加而降低，从而降低了电渗流，使迁移时间变长。本实验在pH 9.23、缓冲溶液浓度20.0～100.0mmol／L范围内，研究了运行缓冲液浓度对被测物迁移时间的影响，最佳缓冲液浓度为50.0mmol／L。
3．1．3 分离电压和进样时间的影响 在一定的毛细管长度下，分离电压决定电场强度。而电场强度影响电渗流速度和荷电物质迁移率，继而决定了分析物的迁移时间。分离电压越高，5组分迁移时间越短。当分离电压超过18kV时，实际样品中待测物不能与其它物质达到基线分离，且基底噪音增大。因而，选择16 kV为最佳分离电压，在23min中内所有组分即可得到很好的分离。
进样时间决定分析样品的进样量，影响峰电流和峰形。在l6kV下，研究了2～12 s范围内进样时间对进样量的影响。峰电流随着进样时间的增加而增加，当进样时间大于8s时，峰高趋于稳定，但峰扩展明显。故在此实验中，选择8s(16kV)作为最佳进样时间。在优化条件下，香叶木素、绿原酸、山奈酚、芹菜素和咖啡酸在23min内即可达到基线分离，所得标准溶液的电泳图谱。
3．2 重现性、线性及检出限
3．2．1重现性 在上述优化条件下，将标准混合溶液(每种标准品的浓度均为2.0 mg／L)连续进样7次，重现性良好。峰高的相对标准偏差(RSD)按照出峰次序分别为：1.1％(香叶木素)、3.7％(绿原酸)、2.2％(山奈酚)、1.3％(芹菜素)和3.0％(咖啡酸)。
3．2．2 回归方程、线性范围及检出限 在最佳分离检测条件下，对一系列不同浓度(5.0×0.0001～0.2g／L)的各组分的混合标准溶液，要分别测定。实验发现，香叶木素、山奈酚与芹菜素的浓度与电泳峰电流在5×0.0001～0.1g／L范围内均呈现良好线性关系；绿原酸与咖啡酸的浓度与电泳峰电流在1×0.001～0.1g／L范围内均呈现良好线性关系。以y表示峰电流(nA)，x表示样品浓度(g／mL)，线性回归方程分别为y =1.70×100000x +0.07(香叶木素，r=O.9994)；y=8.90×10000一0.16(绿原酸，r=0.9991)；y=1.39×100000x一0.10(山奈酚，r=O.9995)；y=3.10×100000x一0.10(芹菜素，r=0.9998)和Y=9.21×10000x+0.07(咖啡酸，r=0.9994)。以信噪比S／N=3对应浓度确定检出限分别为3.8×0.00001g／L(香叶木素)、2.0×0.0001g／L(绿原酸)、4.6×0.00001g／L(山奈酚)、1.9×0.00001g／L(芹菜素)和1.0×0.0001g／L(咖啡酸)。
3．3 样品测定及回收率实验
在选定的测定条件下，对四川和贵州蜘蛛香样品中的5种组分进行了测定，电泳图谱。与标准物质电泳图相对照，四川产蜘蛛香的根中确实含有香叶木素(1)、绿原酸(2)、山奈酚(3)、芹菜素(4)和咖啡酸(5)；而产自贵州的蜘蛛香根中未检出咖啡酸。
以州蜘蛛香的根进行了回收率实验。采用标准加人法，3次测得的回收率均在97％～104％之间，平均回收率和相对偏差(RSD)分别为香叶木素(98.6％，4.7％)、绿原酸(100.9％，2．1％)、山奈酚(103.7％，4.5％)、芹菜素(100.6％，4.3％)和咖啡酸(97.9％，3.4％)。
上述结果表明，该方法无需事先富集或衍生化反应，过滤后即可直接进样，方法简单可靠，能够准确地将不同产地的同种药材区加以区分，从而为传统中草药分离检测提供了一种行之有效的分析方法。
References
1 Chen Lei(陈磊)，Zheng Qingming(郑清明)，Zheng Hanchen(郑汉臣)，Qin Luping(秦路平)，Nian Hua(年华)．Resources of Wild Plants in China(中国野生植物资源)，2002，21(1)：8～11
2 Qie Jiankun(郄建坤)，Qu Huihua(屈会化)，Luan Xinhui(栾新慧)．Chinese Journal of Pharmacy(中国药学杂志)，2002，37(10)：729～733
作者：
爱屋及乌 2007-5-18