高效毛细管电泳研究氯胺酮对映体血药浓度测定方法

摘要　
目的：建立高效毛细管电泳测定氯胺酮对映体血药浓度的方法。
方法：血浆样品用三氯醋酸沉淀蛋白质，缓冲溶液为10mmol^.L^-1羧甲基-β-CD (CM-β-CD)加75mmol^.L^-1磷酸盐缓冲溶液，pH=5.00,紫外检测λ＝210nm。
结果：线性范围为2.5～25.0μg^.ml^-1，平均回收率为101.8%，日内和日间误差分别小于3%和5%。
结论：本方法分析速度快，手性分离效率高，可用于开展临床研究。

　　含手性中心药物分子的立体构型与其和受体之间的相互作用、药理作用及药效存在密切关系，往往一种立体异构体有药效，而其镜象分子药效很小，甚至无药效或药效相反^［1］。氯胺酮(ketamine)是一种非巴比妥类静脉全麻药，其在临床应用时患者常有恶心、情绪不安、幻觉等副作用。研究发现氯胺酮的药效与其立体构型有关^［2～3］。使用色谱法测定氯胺酮血浓度的研究早有报道^［4］，但GC和HPLC操作费用高，色谱柱易受污染。高效毛细管电泳(HPCE)是90年代在手性分离方面得以广泛应用和高度重视的一项高效能分离技术。本实验以羧甲基-β-CD(CM-β-CD)为手性选择剂，利用HPCE技术对氯胺酮对映异构体的手性分离进行研究。

1　材料和方法

1.1　药品与试剂

　　氯胺酮(上海第一制药厂)；羧甲基-β-环糊精(Sigma)；三羟甲基氨基甲烷(上海化学试剂厂，AR)；氢氧化钠、磷酸、三氯醋酸(北京化工厂，AR)；水为二次重蒸馏水。

1.2　仪器与实验条件

　　H-1型高效毛细管电泳仪(中国专利：94111564x,河北大学)，石英毛细管柱58cm(75μm)，有效长度50cm;可调波长紫外检测器，检测波长λ＝210nm，进样和冲洗均通过气压进样装置，进样压力与时间为3.5kPa×5s,冲洗压力为0.4MPa。工作电压为20.0kV。所用溶液均经0.45μm纤维树酯膜过滤，毛细管柱依次用1.0mol^.L^-1NaOH，0.1mol^.L^-1NaOH，蒸馏水冲洗5min，再用缓冲溶液冲洗5min。每次分析后需用缓冲溶液冲洗2min，再进行下次分析。

1.3　试验方法

1.3.1　缓冲溶液的配制　分别称取羧甲基-β-CD(CM-β-CD)和三羟甲基氨基甲烷(Tris)适量，使其浓度分别为7.5mmol^.L^-1和75mmol^.L^-1，用10%磷酸调pH=5.00。
1.3.2　标准溶液的配制　称取氯胺酮对照品适量，用缓冲溶液溶解，配制成浓度为1mg^.ml^-1的储备液，精密吸收储备液一定量，配成含0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7mg^.ml^-1氯胺酮的系列标准液。
1.3.3　HPCE研究氯胺酮对映体的手性分离　考察手性选择剂类型及用量，缓冲溶液组成，pH及用量对手性分离的影响，建立氯胺酮对映体的最佳手性分离条件。
1.3.4　HPCE测定氯胺酮对映体血药浓度标准曲线的制备　精密量取系列标准液10μl,分别加入7支离心管中，加入空白血浆0.2ml，再加30%三氯醋酸50μl，振荡60s,使蛋白质沉淀，3000r^.min^-1离心5min取上清液进样，进行HPCE分析测定，以氯胺酮的浓度为横坐标，色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2　结　果

2.1　手性选择剂对分离效果的影响

　　分别以CM-β-CD和β-CD为手性选择剂，结果发现β-CD仅使氯胺酮的对映体达到部分分离，而CM-β-CD可使氯胺酮的对映体达到基线分离，其最佳用量为7.5mmol^.L^-1。说明CM-β-CD比β-CD对氯胺酮有更强的手性识别能力。因此，本文使用CM-β-CD作为手性选择剂。

2.2　缓冲溶液对手性分离效果的影响

　　以CM-β-CD为手性选择剂，研究不同的缓冲溶液对氯胺酮手性分离效果的影响(表1)和同一种缓冲溶液的不同浓度对手性分离效果的影响。结果表明，以H₃PO₄-Tris为缓冲溶液的分离体系可以获得最好的分离效果，其最佳的使用浓度为75mmol^.L^-1。当pH=5.00时，氯胺酮的手性拆分均获得最大的分离度，图1为pH对CM-β-CD拆分氯胺酮的影响。因此，氯胺酮手性分离的最佳条件为：7.5mmol^.L^-1CM-β-CD，75mmol^.L^-1H₃PO₄-Tris,pH=5.00。

表1　缓冲溶液组成对R_s和△μ的影响

缓冲液

峰宽分离度R_s

表观迁移率差△μ×10^-6cm^2.v^-1.s^-1

H₃PO₄-NaOH

1.17

4.50

H₃PO₄-Tris

1.82

4.00

HAc-NaOH

1.20

3.80

HAc-Tris

1.44

3.70

Glycine-HCl

1.73

4.70

图1　pH与R_s关系图
分离条件：75mmol^.L^-1H₃P_O4-Tris,7.5mmol^.L^-1CM-β-CD，工作电压20.0kV,λ＝210nm

　　图2为氯胺酮血浆样品的手性分离谱图。

图2　氯胺酮血浆样品的手性分离谱图
缓冲溶液：H₃PO₄-Tris75mmol^.L^-1,CM-β-CD7.5mmol^.L^-1,pH5.00

2.3　线性关系

　　血浆中氯胺酮对映体浓度在2.5～25.0μg^.ml^-1范围内，HPCE测得线性回归方程为：Y=1.376X+0.107，r=0.998。

2.4　方法回收率

　　取氯胺酮浓度为5.0，10.0，20.0μg^.ml^-1的血浆样品，按样品处理方法进行处理，测定，求得回收率(表2)。

表2　回收率测定结果.n=5

加入浓度/μg^.ml^-1

实测浓度/μg^.ml^-1

平均回收率/%

RSD/%

5.0

5.08

101.6±2.04

2.02

10.0

10.32

103.2±3.07

3.13

20.0

20.12

100.6±3.13

3.21

2.5　日内、日间精密度

　　日内精密度是1d内配3种浓度的氯胺酮血浆样品，每个浓度连续测定5次。将配好的3种浓度的血浆样品室温放置5d，每天测定1次，得日间精密度，结果见表3。

表3　血浆样品中氯胺酮浓度的日内及日间精密度

浓度/μg^.ml^-1

日内RSD/%

日间RSD/%

5.0　　

2.9

4.8

10.0　　

2.2

3.7

20.0　　

1.6

3.2

3　结　论

　　用HPCE法对氯胺酮对映体血药浓度的定量研究表明，该方法分离效率高，氯胺酮对映体达到基线分离。样品处理简便，试剂耗费少，分析速度快，可用于药物分析和临床血药浓度监测。

作者单位：程庆春　李学仁（保定071000解放军第二五二医院麻醉科）
胡汉芳　王洪　丁天惠（保定071002河北大学化学系)

参考文献