LC/MS联用技术测定蝎毒活性成分的分子量

摘　要　采用LC/MS 联用技术测定蝎毒二级提取物的分子量, 共分离出22个组分, 分子量为3000～4000的有13个组分, 6000～7000的有7个组分, 4169和5566的各一组分。
　　关键词　蝎毒； LC/MS； 分子量； 活性成分； 测定
　　蝎毒是一种生物活性物质, 具有较高的药用价值, 蝎毒粗液经柱层析分离出蝎毒素约30个, 主要为多肽类物质［1］。 近年来, 科学工作者对蝎毒素的分离, 纯化及药理作用进行了研究。 蝎毒的临床应用主要集中在抗肿瘤作用及镇痛作用［2～5］。蝎毒二级提取物, 具有较强的抗癌活性, 虽然对其进行了药理和临床应用研究, 但其基础研究还不充分, 有效成分组成和理化性质(如分子量)尚未进行深入探讨。液相色谱/电喷雾离子化质谱法（LC/ESIMS）是近年来出现的一种新型分离分析联用技术［6］, 对分子量测定具有独特的优势。作者采用该技术对蝎毒二级提取物有效成分的组成及分子量进行了分析。
1　仪器与试剂
　　HP1100 LC/MSD, 该系统包括双高压溶剂泵, 在线真空脱气机, 带恒温单元的自动进样器, 内置柱切换阀的柱温箱以及光二极管阵列检测器和大气压离子化接口的四极质谱检定器, 色谱和质谱数据的采集和处理由HP化学工作站完成。色谱柱：Zorbox 300-SBC18 , 5 μm , 2.1 mm ID ×10 cm，乙腈(色谱纯), 三氟醋酸(TFA) (分析纯), 所用水为经Millipore 纯化水系统的纯净水。
2　流动相的配制
　　流动相 A, 取1.0 ml 三氟醋酸加经微孔滤膜过滤并超声脱气的1000 ml水-乙腈(95∶5)混合溶剂中。
　　流动相 B, 取0.85 ml 三氟醋酸加经微孔滤膜过滤并超声脱气的1000 ml水-乙腈(5∶95）混合溶剂中。
3　色谱分离与质谱条件
　　色谱分离按二元梯度方式进行。梯度洗脱程序: 在0→100 min 内, 流动相A 由95%→40%, 流动相 B 由5%→60%, 流速, 0.35 ml/min。柱后流出物依次经UV和MSD检测。UV检测波长为 210 nm，经UV检测器流出的流份通过三通与添加的TFA-fix溶液(丙酸-异丙醇 = 20∶80)混合在气动辅助方式下进入电喷雾离子化(ESI)喷雾室。
　　质谱检测参数: m/z 扫描范围 400.00～2000.00,干燥气温度 350 ℃, 干燥气流速 12.0 L/min , 雾化气压力 40 Pa, 电喷雾电压4000 V, 离子化方式: ESI, 质谱扫描间隔 0.20 Da, 进样量 50.0 μl。
4　结果与讨论
　　色谱图上各峰的分子量见表1, 图1为HPLC色谱图和MSD总离子流图。
Fig 1.MSD and HPLC of scorpion venom extraction
a, HPLC; b, MSD total ions current chromatogram
　　蝎毒中已分离出的有效成分约30个［1］, 主要是50～70个氨基酸残基组成的多肽, 根据SDS不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳(SDS-PAGE)测定结果, 其分子量在6300～9000之间, 绝大多数为7000～7500, 蝎毒的分离纯化一般采用Sephadex G-50和Sephadex G-25进行, 分子量测定采用SDS不连续聚丙烯酰胺垂直电泳。蝎毒二级提取物经Sephadex G-50和Sephadex G-25纯化而得。经过药理和临床实验得知, 蝎毒二级提取物不但能够高选择性地杀伤肿瘤细胞, 还可减轻化疗时对骨髓造血功能的抑制及增强正常组织对放疗的抗辐射能力［2，3］, 为一种天然, 高效, 副作用小的新型生物性抗肿瘤有效成分。 蝎毒二级提取物虽经Sephadex G-50和Sephadex G-25多次分离纯化, 但本次实验结果表明蝎毒二级提取物仍然是多肽的复杂混合物, 蝎毒二级提取物其HPLC色谱图中有22个峰, 提取各组分的总离子流图的质谱图进行结果分析, 分子量3000～4000的有13个成分, 7000～8000的有7个成分, 分子量为4169和5566的各一个组分。实验结果表明, LC/MS方法分离效果好, 分子量定量准确。

张振中(河南医科大学药学系，郑州 450052)
　饶耀刚(河南医科大学药学系，郑州 450052)
　韩俊(广州市药品检验所， 广州 510000)
　杜斌(河南医科大学药学系，郑州 450052)
　韩雪飞(河南医科大学生物毒素中心， 郑州 450052)
　吴如金(中国药科大学药物分析学教研室， 南京 210009)

参 考 文 献
1，王成裕，雷留根， 韩雪飞， 等. 蝎毒纯化因子Ⅱ对大鼠神经肌肉兴奋性的影响. 河南医科大学学报, 1996，31(3）: 9
2，田爱琴, 马湘玲, 赵培荣，等. 马氏钳蝎蝎毒对食管癌细胞株细胞周期的影响. 河南医科大学学报, 1997， 32(4）: 18
3，董伟华, 臧梦维, 孔天翰，等. 钳蝎蝎毒组分Ⅱ对人直肠腺癌C1184 细胞生长的影响. 肿瘤防治研究, 1995, 22(3): 150
4，李新新, 张瑞德, 刘素珍，等. 辽宁产东亚钳蝎毒对躯体痛作用的影响. 针刺研究, 1997, 28(1) : 73
5，张瑞德, 陈京红, 马晓玲，等. 辽宁产东亚钳蝎毒内脏痛镇痛作用的机理研究. 中国医科大学学报, 1998, 27(1): 12