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摘要 从宁夏枸杞子提取得到的糖缀合物LBP经DEAE-cellulose柱色谱得到5个组分,其中Lbp3, Lbp4和Lbp5分别经CM-Sephadex C-50, Sephadex G-100, Sephadex G-50柱色谱得到均一组分LbGp3, LbGp4和LbGp5。N含量: LbGp3 0.83%, LbGp4 1.72%, LbGp5 9.58%。总糖含量： LbGp3 93.6%, LbGp4 85.6%, LbGp5 8.6%。分子量： LbGp3 9.25×104, LbGp4 21.48×104， LbGp5 2.37×104。糖组成为: LbGp3: Ara∶Glc=1∶1, LbGp4: Ara∶Gal∶Rha∶Glc=1.5∶2.5∶0.43∶0.23，LbGp5: Rha∶Ara∶Xyl∶Gal∶Man∶Glc=0.33∶0.52∶0.42∶0.94∶0.85∶1。初步分析表明LbGp4是O-连接的糖蛋白。
关键词 枸杞子; 糖缀合物; 多糖
枸杞子（Lycium bararum L.）是我国一种传统中药，有“补肾益精，养肝明目”的功效，民间多用来作为延年益寿的补品。近年来证实枸杞子的粗多糖-蛋白复合物为其有效成分之一。但目前这方面的工作主要偏重于药理作用的探讨［1～3］，化学工作，如组分的纯化，结构研究等报道很少。田庚元等［4，5］曾从宁夏枸杞子中得到1个有免疫活性的糖蛋白LbGp。我们对枸杞子中的免疫活性成分进行较系统的研究,分离得到Lbp1～LbP5 5个组份，并对其进行小鼠体内免疫活性试验，发现这5个组份均可提高腹腔巨噬细胞吞噬百分率及体内淋巴细胞转化率。其中对Lbp3, Lbp4和Lbp5分别进行纯化，得到LbGp3, LbGp4和LbGp5，并对这些糖缀合物进行物理化学性质的研究。
材料和方法
材料与仪器 722型，754型分光光度计为上海第三分析仪器厂产品，红外光谱为Bio-Rad FTS185，气相色谱仪为Varian VISTA6000，液相色谱仪为Shimadzu 10AD， 电泳仪为Bio-Rad
的Mini-ProteanR II Electrophoresis cell， 毛细管电泳仪为Water Quanta 4000E，紫外吸收测定仪为Perkin Elmer。
标准蛋白分子量与DEAE-cellulose为Sigma产品, Sepharose 4B, CM-Sephadex C-50, Sephadex G-100和Sephadex G-50为Pharmacia产品。标准葡聚糖分子量为Fluka试剂。其余试剂为国产分析纯。
枸杞子为宁夏产品。
糖缀合物的分离、纯化 生药枸杞子500 g粉碎后，在室温下用3倍体积H2O浸泡24 h，双层纱布过滤，残渣再次用1.5倍体积H2O浸泡6 h，合并滤液。旋转蒸发浓缩（T<40℃）。离心，上清液用4倍体积无水EtOH沉淀。沉淀经少量水溶解后，用1/5体积Savage试剂（CHCl3—n-BuOH 4∶1）去游离蛋白（7次）。对水透析2 d，冷冻干燥，得粗多糖缀合物LBP 4.0 g。
LBP进行DEAE-cellulose柱色谱（HCO-13型），依次用H2O,0.05,0.1,0.25,0.5 mol*L-1 NaHCO3洗脱，隔管检测A280和A490（硫酸—苯酚法），分离得到Lbp1, Lbp2, Lbp3, Lbp4和Lbp5 5个组分（图1）。除Lbp2因量少还未研究外，Lbp1透析脱盐后，经Sephadex G-100纯化得LbGp［1，2］。Lbp3分别经Sephadex G-100(0.1 mol*L-1 NaCl洗脱)和CM-Sephadex C-50(0.2 mol*L-1磷酸缓冲液洗脱)柱色谱得LbGp3,得率为32.5％。 Lbp4经2次Sephdex G-100(0.1 mol*L-1 NaCl洗脱)柱色谱得LbGp4，得率为40.2％。Lbp5经Sephdex G-100(0.1 mol*L-1 NaCl洗脱)和Sephdex G-50(0.1 mol*L-1 NaCl洗脱)柱色谱得LbGp5，得率为20.1％。
Fig 1 Elution pattern of Lbp on DEAE-cellulose column(2 cm×40 cm). Eluent: H2O, 0.05～0.50 mol*L-1 NaHCO3; Flow rate: 0.5 ml*min-1.
纯度鉴定 HPLC法： 分析柱为TSK-2000SW，洗脱液为NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(50 mmol*L-1, pH 7.0), 流速1.0 ml*min-1。 紫外检测波长为254 nm。 毛细管电泳法： 电泳液为100 mmol*L-1 H3BO3-KOH缓冲液（pH 10）。紫外检测波长254 nm。SDS-PAGE电泳法［6］: 用1.5 mol*L-1 Tris-HCl(pH 8.8)缓冲液，分离胶浓度15％，考马斯亮蓝R-250染色。
糖组成分析 纸色谱： 样品加1 mol*L-1 H2SO4 2 ml，充N2，封管，100℃水解4 h后用BaCO3中和进行纸色谱。展开剂为n-BuOH—C5H5N—H2O(6∶4∶2)，显色剂为苯胺-邻苯二甲酸。HPLC法: 纸色谱证实已水解完全后，作HPLC分析。分析柱为Carbohydrate analysis,流动相为乙腈—水（85∶15），流速1.0 ml*min-1，示差检测。气相色谱法: 将完全酸水解样品，按文献［7］方法制成相应的糖醇乙酸酯衍生物，用少量氯仿溶解后进行气相色谱分析，分析柱3％OV-225毛细管柱(25 m×0.3 mm),程序升温180℃(5 min)200℃(30 min)。
分子量测定 LbGp3和LbGp4的分子量测定: 采用凝胶过滤法测定分子量。Sepharose 4B柱(2 cm×50 cm)用0.1 mol*L-1 KCl按恒定流速(10 ml*h-1)平衡24 h。将分子量分别为25000, 80000, 270000, 670000的Dextran标准品相继上柱(每管收集4.4 ml),苯酚-硫酸法测定洗脱峰,测得洗脱体积Ve。用蓝色葡聚糖(分子量200万)求得外水体积Vo。用线性回归法得出回归方程y=-2.5903+3.1021(γ=-0.9977)。按同样条件对待测样品进行柱色谱,由回归方程求得其分子量。LbGp5的分子量测定： 用SDS-PAGE电泳法测定其分子量(条件同SDS-PAGE电泳法)。以牛血清白蛋白、鸡白蛋白、胰凝乳蛋白酶原、β-乳球蛋白和溶菌酶作分子量标准。溴酚兰为指示剂，定其迁移率为1.0，以各蛋白质相对迁移率对分子量对数作出标准曲线，根据样品的相对迁移率可求得其分子量。
LbGp4糖肽键特征［8］ 先将样品置0.1 mol*L-1 NaOH—1.0 mol*L-1 NaBH4溶液中，40℃～45℃反应24 h，然后取样品作薄层色谱。茚三酮显色。
糖含量测定［9］ 用硫酸-苯酚法显色，分别以LbGp3, LbGp4和LbGp5中摩尔比相同的混合单糖作标准，在486 nm处测定。根据它们的标准系列回归方程求出样品中总糖的含量。
UV和IR分析 样品溶于水，浓度1.0 mg*ml-1，于200 nm至600 nm之间进行紫外扫描。测红外光谱时，样品用KBr压片。
结果
LbGp3和LbGp4为白色絮状固体，LbGp5为灰白色固体。LbGp3,LbGp4在紫外200 nm处左右有强吸收，而在280 nm处吸收很弱。LbGp5在200 nm和280 nm处紫外均有较强吸收。红外光谱分析，LbGp3的吸收谱带：1648 cm-1(酰胺键特征吸收，弱),1075 cm-1(糖环特征吸收，强)。 LbGp4的吸收谱带：1645 cm-1(中),1098 cm-1(强)。LbGp5的吸收谱带： 1651 cm-1(强)，1098 cm-1(弱)。N元素分析结果: LbGp3为0.83%，LbGp4为1.72％，LbGp5为9.58％。
LbGp3和LbGp4经毛细管电泳和HPLC（图2，3）分析得到单一对称峰，表明其为均一性。LbGp5经HPLC和SDS-PAGE电泳分析亦表明其有均一性（图4），SDS-PAGE电泳测得其分子量为2.37×104（图5）。凝胶过滤法测得LbGp3和LbGp4的分子量分别为9.25×104, 21.48×104。
Fig 2 Elution of LbGp3 on CZE.Voltage: 20 V, UV 254 nm; Eluent: 100 mmol*L-1 H3BO3-KOH, pH 7.0.
Fig 3 Elution of LbGp4 on TSK 2000SW. Flow rate: 1.0 ml*min-1; Detection: RI; Elution: 50 mmol*L-1 NaH2PO4-Na2HPO4, pH 7.0.
纸色谱和非衍生化的HPLC分析表明LbGp3含有Ara和Gal，LbGp4含有Ara, Gal和微量的Glc，LbGp5用此法未检测到单糖。
糖醇乙酸酯衍生化气相色谱（图6）表明LbGp3含有Ara, Gal,摩尔比为1∶1，LbGp4含有Ara,Gal,Rha和Glc，其摩尔比为1.5∶2.5∶0.43∶0.23。LbGp5含有Rha,Ara,Xyl,Gal,Man和Glc，其摩尔比为0.33∶0.52∶0.42∶0.94∶0.85∶1。
LbGp4经β-消除，薄层色谱结果显示其糖链与肽链是以O-糖苷键连接的。
总糖含量测定结果表明LbGp3为93.6％， LbGp4为85.6％，LbGp5为8.6％。
Fig 4 Photograph of LbGp5 on SDS-PAGE. Line 1. Albumin, bovine(66000) Line 2. Albumin, egg(45000) Line 3. Trypsingen(24000) Line 4. β-Lactoglobin(18400) Line 5. Lysozyme(14300) Line 6. LbGp5.
Fig 5 Plot of migration rates(MR) of standard protein samples and LbGp5 on SDS-PAGE against their lgMW. Line 1. ALbumin, bovine(66000) Line 2. Albumin, egg(45000) Line 3. Trypsingen(24000) Line 4. β-lactoglobin(18400) Line 5. Lysozyme(14300).
Fig 6 GLC of alditol acetate derivatives of carbohydrates on 3% OV-225 column(0.3 mm×25 m). Temp: 180℃(5 min)200℃(30 min) A. Standard sampe: 1. Rha; 2. Ara; 3. Xyl; 4. Man; 5. Gal; 6. Glc.
B. Hydrolyzate of LbGp3.
讨论
试验结果表明，枸杞子中具免疫活性的有效成分是一类结构复杂的糖缀合物。除LbGp5外，都是一些高糖含量的糖蛋白，其中LbGp3的糖含量高达93.6％，这在植物糖蛋白中是极为罕见的。
我们［1］原有的提取分离路线中分别用乙醚和丙酮脱脂和去色素。在试验过程中发现回收溶剂后所得脂类和色素残渣很少，因此省去脱脂、去色素及溶剂回收步骤，并不影响样品纯度，且粗多糖的提取率由0.4％提高到0.8％。
用非衍生化的HPLC和纸色谱对LbGp5进行糖组成分析均未检测到单糖，而用糖醇乙酰化的气相色谱对其进行分析，发现有少量Rha，Ara，Xyl，Gal，Man和Glc。
硫酸-苯酚法测糖含量时，发现用与样品中摩尔比相同的混合单糖溶液作标准是必要的，否则糖含量的测定将出现较大的差异。
此外，Lbp1,Lbp2,Lbp3,Lbp4和Lbp5均有明显的细胞免疫活性，纯化后的LbGp3,LbGp4和LbGp5的活性测定工作正在进行中。