高效液相色谱法测定奈韦拉平的血药浓度

【关键词】 色谱法，高压液相；奈韦拉平；血药浓度

摘要：奈韦拉平（nevirapine）是人体免疫缺陷病毒(HIV1)的非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI). 奈韦拉平与HIV1的逆转录酶(RT)直接连接并通过使此酶的催化端断裂来阻断RNA依赖和DNA依赖的DNA聚合酶活性［1-2］. 奈韦拉平不与底物或三磷酸核苷产生竞争. 我们旨在摸索一种简便、快速、专属性高的测定奈韦拉平血浆浓度的方法.

    1材料和方法

    1.1材料安捷伦1100液相色谱仪（美国安捷伦公司生产）；低温高速离心机（德国SIGMA公司生产）；振荡器（美国科尔帕默仪器公司生产）；万分之一天平（上海衡平仪器仪表厂生产）. 甲醇、乙腈，色谱纯，Merck公司生产；磷酸、磷酸二氢钠、三氯乙酸、三乙胺，AR级，上海化学试剂公司生产. 受试制剂：国产奈韦拉平胶囊剂（商品名艾极），批号0309001，每粒200 mg，浙江华海药业股份有限公司生产；国产奈韦拉平片剂（商品名艾太），批号0402004，每片200 mg，浙江华海药业股份有限公司生产；参比制剂： 进口奈韦拉平片（商品名维乐命），批号304185d，每片200 mg，德国勃林格殷格翰生产；奈韦拉平标准品，批号556503002，含量99.8%，浙江华海药业股份有限公司提供.

    1.2方法

    1.2.1色谱条件色谱柱： Hypersil C18柱（150 mm×4.6 mm,  0.5 μm）；流动相： 乙腈: 0.01 mol/L磷酸二氢钠（含0.01 mol/L三乙胺，磷酸调pH至5.0）=18:82；流速： 1.0 mL/min；柱温： 45℃；检测波长： 240 nm；进样量： 25 μL；灵敏度： 0.01AUFS.

    1.2.2定性获取空白血浆、加入标准品的血浆样品和待测血浆样品的二维色谱图，比较所测成分的保留时间及检测波长是否一致.

    1.2.3血浆样品的预处理取0.2 mL血浆样品，加入20 μL  500 mL/L三氯乙酸，漩涡振荡，4℃下离心5 min（15000 r/min），取上清液25 μL进样，作HPLC分析.

    1.2.4标准曲线的制备取健康人的空白血浆0.2 mL数份，加入奈韦拉平标准品，使其浓度分别为0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.5和5.0 mg/L，按血浆样品处理项处理后作HPLC分析. 以样品峰面积（A）对药物浓度（C）进行线性回归，计算回归方程.

    1.2.5回收率与精密度考察配制含奈韦拉平的标准品0.2, 2.5, 4.5 mg/L的系列血样，日内各浓度重复进样5次，日间各浓度测定1次，连续测定5 d，以所测的浓度与已知浓度相比，计算血样中奈韦拉平的相对回收率和日内、日间精密度.

    1.2.6药代动力学参数计算Cmax, tmax用实测值表示，AUC0-t用梯形法计算. AUC(0-∞)=AUC(0-t)+Ct/λZ, Ct为最后一点的血药浓度，λZ为末端相消除速度常数，t1/2可按t1/2=0.693/λZ求出.

    2结果

    2.1色谱分离与定性从加入标准品的血浆样品的二维色谱图可知，奈韦拉平在12.165 min出峰，比较空白血浆、加入标准品的血浆样品和待测血浆样品的色谱图，奈韦拉平的保留时间基本一致，证明定性成功（图 1）.

    A：空白血浆；B：加入标准品的血浆样品；C：待测血浆样品.

    图1人血浆中奈韦拉平的高效液相色谱图

    2.2线性关系回归方程： C=81.45A+58.65,相关系数（r）=0.9995(n=6)，线性范围0.1~5.0 mg/L. 相关系数的显著性检验P<0.001，说明待测成分在所选的范围内线性关系良好. 本色谱条件下的最低检测浓度为0.1 mg/L.

 2.3专属性本方法专属性高，在该色谱条件下，测得奈韦拉平保留时间为12.165 min，药物峰形良好，血浆中内源性杂质不干扰奈韦拉平的测定.

    2.4精密度和回收率血样中奈韦拉平的相对回收率和日内、日间精密度，其结果见表1. 血样中奈韦拉平的相对回收率为99.41%~100.53%,日内、日间精密度小于10%，符合生物样品分析的有关要求.表1人血浆中奈韦拉平的精密度和回收率

    2.5血药浓度时间曲线采用二重3*3拉丁方设计，24名受试者按照随机顺序接受3种药物（奈韦拉平国产胶囊剂、片剂与进口片剂）200 mg后的平均血药浓度时间曲线见图2. 结果显示，血样中奈韦拉平实测浓度均在本试验线性范围内.

    图2奈韦拉平的平均血药浓度时间曲线

    3讨论

　　测定人血浆中奈韦拉平浓度的方法有高效液相色谱法［3-4］和离子对色谱法［5］. 我们采用高效液相色谱法，血浆内源性杂质不干扰药物的测定. 采用磷酸盐缓冲溶液，调节pH=5，以获得较好的分离度和较短的保留时间. 该方法符合人体药代动力学研究生物样品测定的方法学要求.

    本实验中，对于流动相的选择和药物的萃取进行了大量探索工作，固相萃取可得到较高和较稳定的回收率［6］，却代价昂贵，应用500 mL/L三氯乙酸作为萃取溶剂，回收率高而且稳定，以乙腈和磷酸盐溶液作为流动相［7］，药物峰受到血浆内源性杂质峰干扰，磷酸盐溶液中加入三乙胺，消除杂质峰的干扰，实验方法有较高专属性.

    奈韦拉平是一种抗艾滋病新药，有较多不良反应，会引起肝毒性和耐受性［8-9］. 本次试验过程因志愿者出现不良反应而脱落4例.

　　【参考文献】

    ［1］  Tebas P, Yarasheski K, Henry K, et al. Evaluation of the virological and metabolic effects of switching protease inhibitor combination antiretroviral therapy to nevirapinebased therapy for the treatment of  HIV infection［J］. AIDS Res Hum Retroviruses, 2004,20(6):589-594.

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