重组人粒细胞集落刺激因子肽谱分析方法初探

摘要：目的：建立检测重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)肽谱的方法。方法：采用RP-HPLC法及CZE法。结果：检测rhG-CSF经胰蛋白酶裂解后的肽段，发现九源公司生产的各批产品的一级结构具有一致性。2种分析方法均具有灵敏度高，重现性好等优点。结论：本法适用于基因工程药物的肽谱分析。
关键词　重组人粒细胞集落刺激因子　反相高效液相色谱　毛细管区带电泳　肽谱
　　肽谱是检测基因工程药物质量的重要指标之一，对每一种蛋白来说，肽谱是特征的、专一的。通过肽谱分析，可以鉴别不同批次的产品其一级结构的一致性。目前分析肽谱的常用方法为溴化氰裂解甲硫氨酸位点［1，2］，再利用SDS-PAGE方法分离降解的片段，但此法适用于溴化氰裂解的较大肽段的分析，小片段常易丢失。而反相高效液相色谱(RP-HPLC)法［3］是根据肽段疏水性大小来分离。毛细管区带电泳(CZE)法［4］是根据溶质荷质比不同进行分离，2种方法均可分离分子量较小的肽段。本文采用N-甲苯磺酰基-L-苯基丙氨酸氯甲基酮(N-Tosyl-L-Phenylalanine Chloromethyl Ketone, TPCK)处理的胰蛋白酶裂解rhG-CSF,再用RP-HPLC法或CZE法分析裂解片段，获得满意结果。
1　仪器、试剂及样品
　　Beckman HPLC系统，包括125型泵，168型二级管阵列检测器，System Gold数据处理软件；Beckman P/ACE 5000型毛细管电泳仪。
　　色谱柱：Vydac C18(4.6 mm×150 mm)，5 μm；毛细管柱：Beckman Uncoated, 37 cm×75 μm。
　　TPCK处理的胰蛋白酶为Boehringer公司产品，序列级；三氟醋酸为Sigma公司产品；乙腈为Fisher公司产品；碳酸氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硼砂、硼酸均为国产分析纯。
　　重组人粒细胞集落刺激因子样品来自九源公司。
2　胰蛋白酶酶切方法
　　取浓度为1 mg。mL-1的rhG-CSF样品对0.1 mol。L-1碳酸氢铵透析过夜，以1∶50(w/w)加入TPCK处理的胰蛋白酶，37 ℃酶切20 h，放入-20 ℃冰箱备用，进样前离心去除不溶物。
3　RP-HPLC分析方法
　　色谱条件：流速0.5 mL。min-1，检测波长214 nm，进样量50 μL，梯度洗脱程序见表1［流动相A：0.1%(w/v)三氟醋酸，流动相B：乙腈-水(9∶1)溶液，内含0.1%(w/v)三氟醋酸］。

表1　梯度洗脱程序

4　RP-HPLC法肽谱结果分析
　　rhG-CSF含有175个氨基酸，分子量约为18 000，其分子中含有5个Arg，分别位于第23，147，148，167，170位上，4个Lys，分别位于第17，24，35，41位上。rhG-CSF用胰蛋白酶裂解，理论上有9个裂解位点和8个肽段以及2种单氨基酸。但酶解常不完善或在非Arg, Lys残基上切断，因此会产生更多的分离峰。实验用3批rhG-CSF样品经胰蛋白酶裂解后肽段用RP-HPLC分析，各批间肽图一致(980203号样品肽谱见图1略)。用此方法重复5次，结果完全一致。计算得同一样品中8个主要肽段同一样品中8个主要肽段同一天内出峰时间的RSD均小于1%(表2)。

表2　RP-HPLC肽谱中8个主要肽段出峰时间及日内RSD

5.1　缓冲液pH的影响　考察不同pH的0.05 mol。L-1磷酸缓冲液，在电压12 kV，柱温23　℃，检测波长214 nm等条件不变情况下对rhG-CSF酶切后肽段的分离情况。缓冲液pH 5.8以下，肽段基本上达到基线分离，而且基线相对稳定，但pH 2.5时肽段分离时间比pH 5.8时长1倍。缓冲液pH大于6以上，分离效果均下降(图2)略。实验中选择缓冲液pH 5.8。
5.2　磷酸缓冲液浓度的影响　实验表明硼酸-氢氧化钠体系分离效果均不如磷酸缓冲液，并随着磷酸缓冲液浓度增大，分离效果更好(图3)略，但由于增大缓冲液浓度，电流增大，热效应增加，基线不稳5.3　操作电压的选择　在其它实验条件不变情况下，改变操作电压为5，8，12，15，20 kV，8个主要肽段的迁移时间随电压的增加而减小。在8 kV至20 kV之间，电压对肽段的分离基本上没有影响(图4)。但随着电压的增加，电流增大，热效应增加，实验中选择电压为12 kV。
5.4　样品盐浓度和进样体积的影响　实验表明，0.1 mol。L-1碳酸氢铵不会影响分离，样品无需处理即可分析。进样量若大于5 s，分离效果下降，有若干峰分不开。实验中选择压力进样2 s。
，易产生小的气泡尖峰，影响分离。实验中选择缓冲液浓度为0.05 mol。L-1。

6　CZE的分析方法
　　毛细管柱：37 cm×75 μm，有效长度30 cm；检测波长214 nm；分离电压12 kV；分离时间12 min；柱温23　℃；压力进样2 s；缓冲液为0.05 mol。L-1磷酸盐缓冲液，pH 5.8；每次运行之前用1 mol。L-1盐酸、0.1 mol。L-1氢氧化钠、蒸馏水、缓冲液分别依次冲洗毛细管各3 min。
7　CZE肽谱的分析结果
　　3批rhG-CSF样品经胰蛋白酶酶切后肽段CZE分析，可得批间一致(980203号样品肽谱见图5)。同一酶切后的样品重复进样，考察了8个肽段出峰时间的日内RSD，均小于0.1%(表3)。
表3　CZE肽谱中8个主要肽段出峰时间及日内RSD

8　RP-HPLC肽谱与CZE肽谱比较
　　将RP-HPLC肽谱中8个肽段分别收集，冻干过夜，用蒸馏水溶解后做CZE分析，所出的峰分别与CZE肽谱

表4　出峰时间比较(min)

9　讨论
　　本文建立了胰蛋白酶裂解rhG-CSF后，用RP-HPLC法或CZE法分离检测肽段的方法。方法高度专一，具有重复性好，灵敏度高等特点。RP-HPLC肽谱中各肽段理论塔板数分别为12 173，12 639，13 750，14 646，16 135，15 745，29 926，38 383，缺点是主要肽段需在30 min全部出现，且多余未消化的胰蛋白酶在45 min左右出峰，这样整个肽谱分析过程时间需60 min。而CZE法则克服了传统电泳散热效率不高的缺点，全面改善分离质量。CZE法肽谱中各肽段理论塔板数分别为21 711， 22 754， 41 025， 38 922， 21 478， 26 589， 35 471， 38 752，分析只需ng级的样品，分析时间只需12 min，加上盐酸、氢氧化钠等清洗毛细管，整个肽谱分析过程只需24 min，非常适用于rhG-CSF的肽谱分析。九源公司生产的3批rhG-CSF经RP-HPLC和CZE 2种方法分析，批间均达到一致。推测本法也适用于其它基因工程蛋白质的肽谱分析。

参考文献
1，Vera Nikodem, Jacques R Fresco. Protein fingerprinting by SDS-gel electrophoesis after partial fragmrntation with CNBr. Anal Biochem, 1979, 97: 382
2，饶春明，赵燕平，张向明等.银染SDS-PAGE微量肽图法的改进.生物化学与生物物理进展.1989，16(3)：241
3，Kelly A, Milos Novotny. High-sensitivity peptide mapping by capillary zone electrophoresis and microcolumn liquid chromatography, using immobilized trypsin for protein digestion. Anal Chem, 1989, 61: 2226
4，McCormick R M. Capillary zone electrophoretic separation of peptides and proteins using low pH buffers in modified silica capillaries. Anal Chem, 1988, 60:2322