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摘要:研究了利用微波能对样品进行加热，以H2SO4－甲苯－甲醇体系作衍生化试剂，在消化的同时对血浆中的脂肪酸进行衍生化，然后用GC－MS法测定血浆中脂肪酸。对微波功率、微波加热时间、消解及衍生化试剂等条件进行了优化，测定结果较好。该法整个消化及衍生化过程只需2min，与传统方法相比大大缩短了实验操作时间，特别适用于大量样品的测定。
关键词：微波辅助消解；衍生化；气相色谱－质谱法；血浆；脂肪酸
人体许多疾病如脑血栓、胆石症、糖尿病等的病理机制与血浆中脂肪酸的含量有密切的关系[1]，血浆中脂肪酸含量的异常变动，是病情发展的重要依据；因此，血浆中脂肪酸含量的测定对医学科研及临床诊断具有重要意义。气相色谱法以其强大的分辨力在脂肪酸的分析中受到重视，但由于脂肪酸极性较大测定之前需进行衍生化，目前采用最多的脂肪酸衍生化方法KOH－甲醇法[2]和H2SO4－甲醇法[3]都要在水浴中加热1h左右才能使衍生化进行完全，不适应大量样品的测定。本文研究了在微波加热的条件下，选用H2SO4－甲苯－甲醇体系作衍生化试剂，在消解血浆样品的同时对脂肪酸进行衍生化，测定结果较好。整个消化及衍生化过程只需2min，大大缩短了实验操作时间，特别适用于大量样品的测定。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
MK－1型压力自控微波炉(上海新科微波技术应用研究所)；HP－6890气相色谱仪带质谱检测器(MSD－5973)配G1701B.02.05工作站(Hewlett－Packard,USA)，所用色谱柱为HP5－MS熔融毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm，5％聚苯甲氧基硅氧烷＋95％聚二甲基硅氧烷)；800型离心沉淀机(常州市园华仪器厂)。
甲醇、甲苯、正庚烷、KOH、H2SO4均为分析纯试剂（广州化学试剂厂）；C19∶0为色谱标准；C14∶0、C16∶0、C18∶0、C20∶0、C22∶0均为化学纯，纯度大于98％(上海试剂一厂)。血浆样品为普通冰冻血浆(广州海员医院提供)。
1.2 GC－MS操作条件
色谱条件：进样口温度240℃，柱温采用程序升温，初温140℃，保持3min后以3℃/min速度升至180℃，恒温1min，再以1.5℃/min升至220℃，保持7min；载气为高纯氦气，流速1.0mL/min。
质谱条件：接口温度280℃，EI离子源，电子能量70eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子倍增器电压1500V；质量扫描范围30～550u。
1.3 分析步骤
准确移取0.5mL血浆样品于聚四氟乙烯（PTFE）溶样杯中，加入正十九酸作为内标物，加入甲醇－甲苯－硫酸（体积比为20∶10∶1）溶液5mL，摇动使样品均匀分散于溶液中，盖好塞后放入密闭溶样罐中，旋好外盖，置于微波炉中于600W功率接受辐射40s后取出，放置流水中冷却至常压。将溶液转移至10mL的带盖离心管中，用1～2mL正庚烷分两次洗涤溶样杯，将洗涤液合并于离心管中，加入少量NaCl固体，振荡后将离心管置于离心沉淀机中以3000r/min旋转1min后，取上层有机相进行GC－MS分析。
2 结果与讨论
2.1 衍生化试剂的选择
为选择合适的衍生化试剂，本实验比较了KOH－甲醇及H2SO4－甲醇体系，实验结果见图1(图)。从图1可知，KOH－甲醇体系不能产生脂肪酸甲酯的色谱峰，这主要是由于血浆中含水量为90％～93％，因而在碱性条件下酰基甘油发生皂化而使脂肪酸的羧基全部处于解离状态或成为负离子，没有和醇发生作用的可能性，因而不能在碱性条件下处理血浆。而H2SO4－甲醇体系能较好地在水解酰基甘油的同时对脂肪酸进行衍生化。
据Garces等[4]报道，一定比例的甲醇－硫酸－正庚烷与苯、甲苯或四氢呋喃等溶剂在80℃左右形成单相而在室温下却为两相，上层主要为正庚烷，这一特点特别宜于同时进行样品的消解、酯化及甲酯的萃取。加入苯或甲苯主要是加热溶液形成均相而易于从样品中提取酯类并使之转化为脂肪酸甲酯。他们还通过实验验证了在体系中加入一定量的苯或甲苯能使衍生化效率有较大提高，因而本实验也在体系中加入一定量的甲苯。为进一步验证此体系的效果，本实验利用微波能对C14∶0、C16∶0、C18∶0、C20∶0、C22∶05种脂肪酸标准进行衍生化。结果表明：H2SO4－甲醇体系在微波能作用下能较好衍生化各种脂肪酸，由于对各种脂肪酸的甲酯化使它们在GC中的峰形有较大的改善，避免了色谱峰的拖尾现象，且灵敏度也得到了提高，因而本实验选用H2SO4－甲醇－甲苯体系作为消解及衍生化试剂。
2.2 微波消解及衍生条件的选择
为优化微波消解及衍生化测定血浆中脂肪酸的实验条件，对微波功率（198W，330W，600W）、微波加热时间（40s，60s，120s）、消解及衍生化试剂（含H2SO4，φ分别为2％，3％，4％）3个实验条件按3因素3水平正交设计进行试验选优。从实验结果可知，各脂肪酸在相同色谱条件下的峰面积随试验条件有所不同，但从总体而言，600W微波功率、甲醇－甲苯－硫酸（体积比为20∶10∶1）作消解衍生化试剂、微波加热2min所得结果最好。通过对实验结果作趋势图分析发现，各脂肪酸的峰面积有随着甲醇－甲苯－硫酸体系中酸度的增大以及微波加热时间的延长而增加的趋势，因此本实验进一步作了酸度增强以及微波加热时间延长的试验。试验结果表明，硫酸在体系中所占比例超过4％（φ）时，微波加热时间超过2min，则血浆溶液经正庚烷提取，加入NaCl离心后样品溶液形成凝胶状半固态物质，不能分层。这是由于血浆中脂肪酸大多与蛋白质相结合形成血浆脂蛋白，而蛋白质的热致变性是最常见的变性现象。蛋白质的变性除与蛋白质的本质有关外，还与蛋白质的纯度和溶液的pH值不同以及所处温度高低及时间有关。pH值较低、温度很高或长时间处在较高的温度下，则蛋白质的变性将是不可逆的，反之，若酸度趋于中性、温度较低、暴露时间短，则变性将是可逆的[5]，因而消解及衍生化试剂体系中酸度及微波加热时间的影响较大，必须仔细选择。本实验选用600W微波功率、甲醇－甲苯－H2SO4(体积比20∶10∶1)、微波加热2min为最佳实验条件。
2.3 消解及衍生后溶液处理
经微波消解及衍生化的血浆溶液由于其中含有较多蛋白质等物质，易使溶液形成浑浊的乳浊液，为较快地使有机相与水相分层，也为增大脂肪酸在有机相和水相中的分配比，一般采用盐析法。实验发现加入NaCl固体处理消解及衍生化的血浆溶液得到内标物正十九酸的灵敏度较高（见图2）(略)，这与酰基甘油在酸性条件下水解反应是可逆的，加入NaCl有利于脂肪酸的形成有关；实验还证实加入100g/LNaCl溶液不及直接加入NaCl固体的效果好，故加NaCl固体处理消解及衍生化的血浆溶液。
2.4 微波消解衍生化与水浴加热消解衍生方法比较
取0.5mL血浆样品加入5mL甲醇－甲苯－硫酸消解衍生化试剂，于60℃水浴中充氮气加热1h进行消解衍生化。所测得各种脂肪酸甲酯的峰面积与600W微波功率加热2min的结果进行比较（见图3）(略)。从图中结果可知，微波辅助衍生化（MAD）比水浴加热衍生化（WHD）效率高，且由于微波辅助衍生化加热时间较短，蛋白质不易变性，避免了水浴加热时由于长时间处于较高温度下蛋白质变性，形成凝胶状半固态物质而不能分层的现象。
3 结论
本文优化了微波辅助衍生化测定血浆样品中脂肪酸的实验条件。在600W微波功率下，利用甲醇－甲苯－硫酸体系作消解及衍生化试剂，微波加热2min得到较好的结果。该法将样品的消解、脂肪酸的衍生化及脂肪酸甲酯的萃取融于一体,与水浴加热相比，具有灵敏度高、省时、省试剂、操作方便等特点，且由于加热时间较短，蛋白质不易变性，使实验条件更易实现。本法特别适用于食品、生物等含水的大批量样品中脂肪酸的测定。
参考文献：
[1] 苗靖， 陈正华， 张丽敏， 李 浩. 健康人血液中游离脂肪酸含量的测定[J]. 分析化学， 1998， 26（3）： 336.
[2] 吴惠勤， 程青， 张桂英. GC/MS法分析鳗鱼骨油的脂肪酸[J]. 分析测试学报， 1995， 14（3）： 28.
[3] 张 强. 贻贝脂肪酸成分分析[J]. 分析化学， 1997， 25（1）： 93.
[4] GARCES L， MANCHA M. One-step lipid extraction and fatty acid methyl esters preparation from fresh plant tissues[J]. AnalBiochem， 1993， 211（2）： 139.
[5] HANDDA A，TAKAHASHI K， KURODA N， FRONING G W. Heat-induced egg thite gels as affected by pH[J]. J Food Sci，1998， 63(3)： 403.