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【关键词】 熟地黄
RPHPLC determination of 5hydroxymethylfurfural in prepared rehmannia root
【Abstract】 AIM: To develop a HPLC method for the determination of 5hydroxymethylfurfural (5HMF) in prepared rehmannia root. METHODS: The RPHPLC method was used. The analytical column was a ZODBAXC18（4.6 mm×150 mm, 5 μm） and the mobile phase consisted of methanol 0.01 mol/L phosphoric acid aqueous solution (70∶30). The wavelength was set at 284 nm with the Detector and the flowrate 0.8 mL/min, the column temperature 25℃ and the injection volume 20 μL. RESULTS: Over the range of 0.44-2.18 μg, a good linear relation existed between 5HMF and the peak area (r=0.999 9, n=5). The average recovery of the added sample was 99.0% and RSD 0.8% (n=6). CONCLUSION: The proposed method can be used for quantitatively analyzing 5HMF in a convenient and economic way, with high accuracy and good reproducibility. This method for the determination of 5HMF in prepared rehmannia root can be popularized.
【Keywords】 radix rehmanniae praeparata; reversed phase highperformance liquid chromatography; 5hydroxymethylfurfural
【摘要】 目的：建立测定熟地黄中5羟甲基糠醛(5HMF)含量的方法. 方法：采用反相高效液相色谱法，以ZODBAXC18(4.6 mm×150 mm，5 μm)为色谱柱，流动相为甲醇与0.01 mol/L磷酸溶液(70∶30)，检测波长为284 nm，流速0.8 mL/min，柱温：25℃，进样量：20 μL . 结果：5HMF在0.44～2.18 μg范围内与峰面积线性关系良好，r=0.9999，5HMF平均加样回收率为99.0%，RSD为0.8%（n＝6）. 结论：采用反相高效液相色谱法简便、快捷、可靠性高，准确性和重现性好，确定是一种值得推广应用的检测熟地黄中5HMF的含量方法.
【关键词】 熟地黄；反相高效液相色谱法；5羟甲基糠醛
0 引言
熟地黄首载于《本草图经》，为玄参科多年生草本植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch的根，经加工炮制而成. 熟地黄在临床上应用较为广泛［1］. 熟地黄含有梓醇、糖类、甙类、5羟甲基糠醛(5HMF)等化学成分，其中5HMF是熟地黄质量控制的量化指标之一［2］. 文献报道生地黄炮制成熟地黄后5HMF的含量增加20倍左右［3］. 而5HMF对人体横纹肌及内脏有损害［4］；具有神经毒性，能与人体蛋白质结合产生积蓄中毒［5］. 熟地黄中5HMF含量测定报道较少，如薄层扫描法（TLCS）［3，6］. 但TLCS法操作复杂、受试条件重复性差. 我们采用RPHPLC法测定了3种不同产地的生地黄经相同方法加工炮制而成的熟地黄中5HMF的含量，建立了测定熟地黄中5HMF含量的方法.
1 材料和方法
1.1材料
DIONEX Summit 680高效液相色谱仪(美国)：P680 HPLC PUMP，Thermostatted Column Compartmemt TCC100, PDA100 Photodiode Array Detector，Chromenleon Chromatography Management System；SK250LH型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）. 5HMF对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111626-200301）；熟地黄（西安市药材公司提供，经第四军医大学药物研究所王四旺主任药师鉴定为玄参科多年生草本植物地黄的根炮制而成）；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯.
1.2方法
1.2.1色谱条件色谱柱：ZODBAXC18分析柱（4.6 mm×150 mm,5 μm）；流动相：甲醇-0.01 mol/L磷酸溶液(70∶30)；流速：0.8 mL/min；柱温：25℃；检测波长：284 nm；进样量：20 μL.
1.2.2供试品溶液与对照品溶液的制备取本品细粉2.0 g，精密称定，置于25 mL量瓶中,加甲醇20 mL，密塞，超声提取1 h，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，过滤提取液，精密吸取2.5 mL置于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液. 另精密称取5HMF对照品10.9 mg，加甲醇溶解并定容至25 mL量瓶中，制成0.436 g/L的对照品溶液.
1.2.3线性关系精密吸取0.5，1，1.5，2，2.5 mL对照品溶液，分别置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，分别精密吸取20 μL进样，测定峰面积.
1.2.4精密度试验在室温条件下，取质量浓度为0.0654 g/L的5HMF对照品溶液连续6次进样，每次20 μL.
1.2.5稳定性试验取上述制备的供试品溶液，室温放置，在0，1，2，4，6，8 h分别进样20 μL.
1.2.6重现性试验取熟地药材细粉6份，每份2.0 g，分别置于25 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，依2.2项下方法制备供试品溶液并测定.
1.2.7加样回收试验精密称定6份已知含量的熟地黄细粉120 mg置于10 mL量瓶中，分别精密加0.436 mg/L的5HMF对照品溶液1 mL，然后加入甲醇7 mL，摇匀，按上述方法制备供试品溶液并测定.
1.2.8样品测定精密称取3种不同产地的生地黄经相同方法加工炮制而成熟地黄各2.0 g，分别置于25 mL量瓶中, 加入甲醇20 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定5HMF峰面积.
2 结果
以5HMF对照品进样量（μg）为横坐标（X），以测定的5HMF峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算得回归方程为：Y=58.48+8012.12X，r=0.9999 (n=5，P＜0.05). 结果表明5HMF在0.436～2.18 μg范围内与峰面积呈良好线性关系. 6次重复进样测得5HMF峰面积RSD为0.7%，表明仪器精密度良好. 稳定性试验测得8 h内5HMF峰面积的RSD为1.3%，结果表明，5HMF在甲醇溶液中8 h内稳定. 重现性实验中测定的6份熟地药材细粉中，5HMF的平均质量分数为2.81 mg/g，RSD=1.0%. 加样回收试验测定5HMF的平均回收率为99.0%，RSD=0.8%. 样品测定，根据测定的5HMF峰面积计算样品中5HMF的含量（表1, 图1）.表1熟地黄中5HMF的含量测定（略）
3 讨论
在本实验给定的条件下，基线平稳，出峰时间短，峰型好. 张清波等［6］曾报道HPLC测定熟地黄中5HMF的含量，但我们在其给定的流动相和检测波长下，以ZODBAXC18分析柱为色谱柱进行实验，发现5HMF的色谱峰出现拖尾和分叉现象，且流动相极性太低，出峰时间较长. 因此，我们对实验条件进行改进.
在提取熟地黄中5HMF的过程中，我们曾用氯仿、甲醇、乙醇、水四种溶剂及甲醇、乙醇的水溶液，由于在加热的过程中熟地中的糖类物质会转变为5HMF［3］，因此我们选用超声方法进行处理. 实验结果发现用不同溶剂按相同的方法进行提取，5HMF的含量和色谱图的差异较明显，其中，甲醇的提取物基本上出现单峰. 本文测定的熟地黄中5HMF的含量高于文献报道值［3］， 是炮制方法的不同还是测定方法精密度和准确度的提高造成熟地黄中5HMF含量差异，有待进一步研究.
【参考文献】
［1］ 黄霞. 熟地黄现代研究进展［J］. 内蒙古中医药, 2004,23(5):25-26.
［2］ 冯建明，赵仁. 三种地黄炮制品现代研究进展［J］．云南中医学院学报, 2000,23(12):40-42．
［3］ 刘美丽,白玫,白荣枝,等. 地黄的炮制研究I：熟地黄中5羟甲糖醛的提取分离及含量测定［J］．中草药，1995,26(1):13-14.
［4］ 楚文，张昌斌，曹永红,等. 限制5羟甲基糠醛生成条件和探讨［J］.人民军医药学专刊，1998,14(2):101.
［5］ 饶品昌,黄道明. 薄层扫描法测定熟地黄中5羟甲基糠醛的含量［J］. 中成药,1998,20(8): 20-21.
［6］ 张清波，乔菲，陈晓雪，等. HPLC法测定熟地黄中5羟甲基糠醛的含量［J］. 中国药品标准,2001,2(4):33-34.