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【摘要】 目的 建立反相高效液相色谱法配合电化学检测器测定动物源食品中大观霉素残留。方法 用三氯乙酸匀浆抽提以脱去试样中的蛋白，然后用二氯甲烷去除试样中的脂溶性物质，再经LCSCX阳离子固相萃取小柱净化处理，产物进行检测。流动相为离子对缓冲体系(0.02mol/L柠檬酸∶0.004mol/L庚烷磺酸钠，50% NaOH调pH至6.10)∶乙腈(体积比为92.5∶7.5)，流速0.6ml/min，工作电极电压1.0V，柱温35℃，检测波长254nm。结果 大观霉素在0.01～10.0μg/ml范围内线性关系良好，相关系数R=0.99998。结论 该法简便、直接、准确。
【关键词】 反相高效液相色谱 电化学检测器 大观霉素 残留
Determination of spectinomycin residues in animal food by RPHPLC
Yuan Li, Hu Gongzheng, Xiao Chuanbin, Liang Jun, Li Kui and Si Hongbin
(Engineering College of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002)
ABSTRACT Objective A reversedphase high performance liquid chromatography (RPHPLC) method with electrochemical detector was established for the determination of spectinomycin residues in animal food.Methods The samples were deproteinized by trichloroacetic acid, and the fatty soluble substances were extracted with dichloromethane. Followed by cleanedup on a LCSCX positive ion solidphase extraction column, then the extracts were determined. The mobile phase was citric acid ionpair buffer solution (0.02mol/L citric acid∶0.004mol/L sodium heptanesulfonate, the pH adjusted to 6.10 by 50% NaOH)∶acetonitrile (92.5∶7.5, V/V). The flow rate was 0.6ml/min, the working electrode voltage was 1.0V, the column temperature was maintained at 35℃, and the detection wavelength was at UV 254nm. Results The linear relationship of the peak and concentration of spectinomycin was determined as 0.01～10.0μg/ml, with a regression coefficient of 0.99998. Conclusions The method is simple, direct,and accurate.
KEY WORDS RPHPLC; Electrochemical detector; Spectinomycin; Residues
大观霉素(spectinomycin，曾译壮观霉素)是氨基糖苷类抗生素，主要通过作用于细菌核糖体30S亚基来抑制其蛋白质的合成，对革兰阴性菌(如大肠埃希菌、沙门菌、布鲁菌、变形菌、铜绿假单胞菌、巴氏杆菌等)有较强作用，对革兰阳性菌和支原体亦有一定作用。我国兽药典兽药使用指南(化学药品卷，2005版)［1］及美国FDA均规定本品在牛、羊、猪、鸡等食用组织中最高允许残留量分别为：肌肉：500μg/kg；脂肪、肝：2000μg/kg和肾：5000μg/kg。国外一些学者建立了各种HPLC法［2～6］来检测动物源食品中本品的残留，但大观霉素无紫外吸收，必须形成紫外可见光或荧光化合物后才能进行HPLC分析［7，8］，即必须先进行衍化生成相应的衍化物。迄今为止，所有这些方法即缺乏必要的灵敏度，亦有繁杂的衍化过程，难以推广应用。1994年美国农业部又建立微生物学方法来检测本品在食品中的残留，但其灵敏度也低，且缺乏特异性。Elrod等［9］发现大观霉素具有电化学活性，发展了一种使用离子对色谱电化学检测器的方法测定大观霉素，但并未用该法测定生物样品。Schermerhorn等［10］报道用带有电化学检测器的HPLC来检测牛奶中的大观霉素残留。我国进出口商品检疫局1997年发布了出口肉及肉制品中大观霉素残留检测的HPLC电化学法，测定方法灵敏度高，但样品提取步骤繁杂，不适用于脂肪组织，其净化过程系用活性炭制柱，处理后的待检液中的杂质仍干扰测定结果。本方法采用三氯乙酸抽提去除样品中的蛋白、二氯甲烷去除试样中脂溶性物质，经LCSCX阳离子固相萃取小柱净化处理，再用反相高效液相色谱配合电化学检测器直接检测动物源食品中残留的大观霉素，结果表明，本方法简单、直接，且回收率、检测限和准确度均可达到相关标准。
1 仪器和试药
1.1 仪器
带515泵、2465电化学检测器的高效液相色谱仪(美国Waters公司)、电子天平(感量0.0001g)、高速组织捣碎机、回旋式振荡器、高速冷冻离心机和Supelclean LCSCX SPE阳离子固相萃取小柱(500mg/3ml，含碳量≥14%)。
1.2 试药
大观霉素为山东鲁抗生产，含量不少于99.0%；乙腈(色谱纯，Baker公司)，庚烷磺酸钠(色谱纯，Sigma公司)；水为色谱级超纯水(采用Millipore公司纯水系统自制)；带一个结晶水的柠檬酸、甲醇、氢氧化钠、氯化钠、三氯乙酸和二氯甲烷均为分析纯试剂。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：C18柱(瑞典AKZO NOBEL Kromasi C18，250mm×4.6mm，5μm)；保护柱(LabALLianceTM C18)；流动相为柠檬酸离子对缓冲体系(0.2mol/L柠檬酸∶0.004mol/L庚烷磺酸钠，50% NaOH调pH至6.10)∶乙腈(体积比为92.5∶7.5)，流速为0.6ml/min，工作电极电压1.0V，柱温35℃，检测波长254nm，进样量20μl，分离结果见图1。
2.2 标准曲线的绘制
准确称取大观霉素0.0298g，加水溶解并定容为100ml，配成浓度为200μg/ml的储备液(按有效量计)，置4℃冰箱中保存，一周内用完。临用前， 取此储
图1 大观霉素标准溶液的高效液相色谱图(20μg/ml)备液用纯水稀释成0.01、0.02、0.05、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μg/ml浓度的大观霉素标准溶液，在“2.1”色谱条件下进样，经电化学检测器检测，按其所得峰面积与对应的标准液浓度作标准曲线，并计算回归方程为：
A=0.75468+16.53266C R=0.999976
表明大观霉素在0.01～10.0μg/ml范围内线性关系良好。
2.3 样品处理
2.3.1 抽提 称取(15g±0.05g)试样，转至一个50ml的离心管中，加入12ml超纯水，在1800r/min条件下用高速组织捣碎机捣1min，取粘稠液18g加50%三氯乙酸2ml和二氯甲烷10ml，在回旋式振荡器上高速振摇30min。然后在4℃ 3800RCF［RCF=0.0000118×R×N2，R为离心半径(cm)，N为转速(r/min)］条件下离心30min，取上清10ml，加二氯甲烷2ml，在回旋加速器上振荡混合20min，再在4℃ 12000RCF条件下离心30min，上清液即为药物的抽提液。
2.3.2 净化 采用LCSCX阳离子固相萃取小柱净化。首先LCSCX小柱用甲醛活化，再用纯水平衡后，将经“2.3.1”法制得的备用液过柱，起始2ml弃去，收集随后3ml，经水性滤膜(0.45μm)过滤，滤液供HPLC测定。对肌肉和脂肪内本药的残留测定，可取“2.3.1”法制得的抽提液直接过0.45μm水性滤膜即可。
2.4 试样中药物残留量计算
经“2.3”方法处理过的组织待测试样在“2.1”色谱条件下进样，经电化学检测器检测，空白鸡脂肪组织、鸡肉组织、鸡肝脏组织和鸡肾脏组织HPLC杂质峰不干扰加药(加药量为最高残留限量)后试样的HPLC色谱图(图2)，大观霉素峰依次位于10.43、10.63、10.62和10.54min。将其所得峰面积带入标准曲线回归方程，可求出试样中残留的药物浓度或药物含量。
2.5 灵敏度、回收率和精密度试验
图2 加药鸡脂肪组织的高效液相色谱图(2μg/g)
用添加法测定。分别取猪、鸡空白肌肉、脂肪、肝、肾组织各15.0g，添加适量的大观霉素标准溶液，按“2.3”方法处理后在“2.1”色谱条件下进样，经电化学检测器检测，将其所得峰面积带入标准曲线回归方程，计算大观霉素含量，以加入量与测得量之比计算回收率。每种组织各测定包括最高残留限量和灵敏度在内的三种添加浓度，每个浓度各测3批样品计算批间变异系数，每批样品各进行5个重复计算批内变异系数。
结果表明，猪、鸡肌肉、脂肪中本品的检测限为100μg/kg，肝脏、肾脏中的检测限为200μg/kg，均低于最高允许残留量［1］。各浓度点回收率均在71.38%～94.81%范围内。本方法的批内变异系数在4.19%～9.86%范围之内，批间变异系数在4.86%～12.99%范围之内。
2.6 抗干扰试验
鉴于大观霉素在畜禽疾病防治中多与林可霉素复配使用，故进行了林可霉素对大观霉素在本实验条件下的干扰试验。结果表明，当用同时含10μg/ml林可霉素和10μg/ml大观霉素的标准混合溶液按上述方法进行测定时，无林可霉素色谱峰，仅有大观霉素峰，且其保留时间及峰面积与单独测定10μg/ml大观霉素标准溶液时一致，说明林可霉素对大观霉素的测定无影响。
3 讨论
(1)抽提液的选择 氨基糖苷类抗生素与组织成分结合较紧密，从组织样品(尤其是肾)中抽提本品要比从体液中困难的多，迄今为止，报道的方法不多［5，7，11］，且灵敏度不高，只适于测定氨基糖苷类抗生素残留量高的样品(如肾)。Schermerhorn等［10］报道先用三氯乙酸沉淀试样中的蛋白质，再用二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯按顺序液液萃取，但此试样中的共萃物对色谱柱的分离有干扰，影响了检测的灵敏度，且步骤复杂，回收率低。本方法采用三氯乙酸匀浆抽提以脱去蛋白，然后再加二氯甲烷以除去脂溶性物质，结果表明本抽提方法简单可行，回收率较高，且能保证检测的灵敏度。
(2)净化方法的选择 由于Hornish等使用的自动净化系统［7］不符合国内多数实验室配置条件，且CBA阳离子固相萃取柱在萃取操作过程要求精确调节pH值、温度及离子强度，所需条件难以掌握，且样品回收率较低，故本试验采用LCSCX阳离子固相萃取小柱净化，其仅能保留试样中的干扰成分，而不能保留试样中的残留药物，并使之滤过流出，起到较好的净化作用。为尽可能多的除掉试样中的杂质，以免进样后堵塞HPLC系统或污染色谱柱，本方法在试样经LCSCX阳离子固相萃取小柱净化后采用水性滤膜进一步过滤，结果证实本处理对保护色谱柱是有利的，也是可行的。
(3)流动相的选择及工作电极电压的确定 本方法经多次重复证明，大观霉素的保留时间与离子对缓冲液中庚烷磺酸钠(在其浓度不大于柠檬酸浓度范围内)浓度成正相关，与流动相中乙腈的浓度成负相关。当采用柠檬酸离子对缓冲体系(0.02mol/L柠檬酸∶0.004mol/L庚烷黄酸钠，50% NaOH调pH至6.10)∶乙腈(体积比为92.5∶7.5)为流动相时，大观霉素有适宜的保留时间(保留时间为9～15min)，与杂质能完全分离，并能达到基线分离，且峰形良好。
为提高选择性及信燥比，必须优化电化学检测器工作电极的电压，过高外加电压使电化学检测器噪声增加且干扰严重；如外加电压不足，则又使信号变小，电化学检测器灵敏度降低。本方法选择1.0～2.0V的工作电压来分析大观霉素经证实是恰当的。
4 结论
根据我国HPLC及净化系统的配置情况，并结合离子对色谱及电化学检测的优点，该分析方法为一种简单的直接测定动物源食品中大观霉素残留的方法，其检测限、回收率、重复性和线性范围均能满足现行兽药残留分析的要求。
【参考文献】
［1］ 中国兽药典委员会. 中华人民共和国兽药典兽药使用指南化学药品卷［S］. 北京：中国农业出版社，2006：32
［2］ Burton S D, Hutchins J E, Fredericksen T L, et al. Highperformance liquid chromatographic method for the determination of spectinomycin in turkey plasma ［J］. J Chromatogr,1991,571:209
［3］ Haagsma N, Keegstra J R, Scherpenisse P. Highperformance liquid chromatographic determination of spectinomycin in swine, calf and chicken plasma ［J］. J Chromatogr,1993,615(2):289
［4］ Bergwerff A A, Scherpenisse P, Haagsma N. HPLC determination of residues of spectinomycin in various tissue types from husbandry animals ［J］. Analyst,1998,123(10):2139
［5］ Carson M C, Heller D N. Confirmation of spectinomycin in milk using ionpair solidphase extraction and liquid chromatographyelectrospray ion trap mass spectrometry ［J］. J Chromatogr Biomed Sci Appl,1998,718(9):95