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【摘要】 应用液相色谱2电喷雾电离三级四极杆质谱（LC2ESI2MS/MS）方法测定茶叶中呋虫胺、噻虫嗪、噻虫胺、吡虫啉、啶虫咪和噻虫啉烟碱类农药残留。前处理方法包括添加同位素内标吡虫啉2D4，乙腈提取,再用活性碳和Oasis(HLB)固相小柱净化。该方法采用正离子方式，多反应监测每种烟碱类杀虫剂各两对离子进行定性、定量分析。方法在0.01～0.4 mg/kg范围内具有良好的线性关系。实验了3个添加水平0.02、0.04和0.2 mg/kg，回收率范围为80.1%～106.1％；相对标准偏差小于9.7％；方法检出限(LOQ)均为0.02 mg/kg。本方法简便、快速、准确，各项技术指标满足国内外法规的要求，可用于茶叶样品中烟碱类农药残留的确证检测。
【关键词】 茶叶 液相色谱 电喷雾电离三级四极杆质谱法 烟碱 农药残留
1 引言
烟碱类杀虫剂是20世纪70年代壳牌公司发明的一类新化合物, 这类化合物作用于烟碱样乙酰胆碱受体(nicotin acetylcholine receptors, nAChRS),且结构中含有硝基亚甲基杂环的四氢21,32噻嗪(nithiazine,SKI271),称为第一代烟碱类杀虫剂。为了改进其不稳定性而引入含氮原子的芳杂环甲基基团作为22硝基亚甲基咪唑烷五元环系统的氯代烟碱类称为第二代烟碱类杀虫剂。迄今为止,已有以吡虫啉为代表的十几种新烟碱类杀虫剂产品相继商品化,如: 吡虫啉(imidacloprid)、啶虫脒(acetamiprid)、噻虫嗪(thiamethoxam)、噻虫啉（thiacloprid)、噻虫胺(clothiandin)及呋虫胺(dinotefur)。也有文献认为呋虫胺只有32四氢呋喃甲基结构,而不具有其它新烟碱类化合物所具有的吡啶结构,而把它称为第三代烟碱类杀虫剂[1,2]。烟碱类杀虫剂通过与烟碱型的乙酰胆碱受体结合,使昆虫异常兴奋,全身痉挛麻痹而死,对粮食作物、油料、蔬菜及水果等多种虫害有防治效果。吡虫啉近年在我国茶叶生产中应用较广，用以防治小绿叶蝉、黑刺粉虱，能替代噻嗪酮。日本规定茶叶中6种烟碱类农药最高残留限量（MRLs）为10～50 mg/kg[3]； 欧盟规定茶叶中吡虫啉、啶虫咪的MRLs分别为0.05和0.1 mg/kg。
目前文献报道用高效液相色谱法测定（HPLC）测定茶叶、蔬菜、水果中吡虫啉[4～６]的残留。上述方法检出限在0.03～0.05 mg/ kg之间；随着LC2ESI2MS/MS技术发展的日趋成熟，该方法被广泛用于测定和确证食品中农药残留。文献[6～９]检测蔬菜、茶叶和水果中吡虫啉或啶虫脒，方法的检出限为0.001～0.05 mg/kg。文献[１０]检测蜂蜜中啶虫脒、吡虫啉、噻虫嗪农药，方法的检出限为0.01～0.1 mg/kg。文献[1１]检测桃子、梨、小胡瓜、芹菜和杏中啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪方法检出限为0.1～0.5 mg/kg。茶叶较蔬菜、水果等样品杂质干扰大、色素深，样品净化难度大。目前尚未见检测茶叶中6种烟碱类杀虫剂的液相色谱2质谱/质谱法的报道。本实验提出了添加同位素内标吡虫啉2D4，用乙腈提取茶叶中6种烟碱类农药，再用活性碳和Oasis(HLB)固相小柱净化，LC2ESI2MS/MS测定。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
API4000液相色谱2串联质谱仪：配有电喷雾离子源和大气压化学源（美国AB公司）；活性碳SPE柱（500 mg, 6cc, Supecol公司）；Oasis HLB SPE柱(500 mg, 6cc, Waters公司)。
甲醇、乙腈为色谱纯；无水Na2SO4为分析纯；呋虫胺、噻虫嗪、噻虫胺、吡虫啉、啶虫咪、噻虫啉和吡虫啉2D4标准物质（纯度≥97.5%，Dr Ehrenstorfer GmbH公司）；储备液用甲醇配制，贮存在4 ℃的冰箱中，根据需要用乙腈20.15%甲酸溶液(3∶7,V/V)溶液稀释至适当浓度的标准工作液。实验用水为Milli2Q高纯水。
2.2 液相色谱与质谱条件
ZORBAX Eclipse XDB2C8色谱柱（150 mm×4.6 mm, 5 μm）；流动相：乙腈（A）和0.15%甲酸溶液（B）, 梯度洗脱程序： 0 min时，30% A； 0～3.5 min，线性增加至70％ A；8～10 min，降至30% A，之后进行系统平衡。流速：0.4 mL/min；进样量：20 μL。
扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电喷雾电压:4800 V；雾化气压力(GS1): 0.289 MPa；气帘气压力: 0.172 MPa；辅助气压力(GS2): 0.31 MPa；离子源温度: 540 ℃；碰撞气:0.0414 MPa；其它条件见表1。
表1 烟碱类农药标准品信息和优化质谱条件（略）
Table 1 Standard information and optimized mass spectrometric parameters of neonicotinoid pesticides
2.3 样品处理
称取0.500 g茶叶样品置于50 mL塑料离心管中，加1 mL水浸泡0.5 h, 加入0.4 mL吡虫啉2D4(100 μg/L)和10 mL乙腈,均质，离心，将上层乙腈提取液过无水Na2SO4柱置于浓缩瓶，以除去乙腈中的少量水，再加入10 mL乙腈，重复上述操作，合并乙腈提取液，再用5 mL乙腈洗涤无水Na2SO4柱，在低于50 ℃的水浴中减压浓缩至约4 mL，待过柱。上述溶液转移至活性碳小柱（用5 mL乙腈预洗）,再用5 mL乙腈洗脱，收集全部洗脱液，在低于50 ℃的水浴中减压浓缩至近干。用10 mL水分两次将残渣转移至Oasis HLB 小柱中（依次用5 mL甲醇，5 mL水预洗），再用5 mL水和5 mL V（甲醇）∶V（水）＝1∶9的混合溶液依次洗涤浓缩瓶，洗涤液过固相萃取小柱，弃去流出液，在负压下抽干。用6 mL甲醇洗脱，控制流速在1～2 mL/min，收集全部洗脱液于10 mL离心管中。洗脱液在低于50 ℃的水浴中减压浓缩至近干，用2.0 mL V（乙腈）∶V（0.15%甲酸）＝3∶7的混合溶液溶解，过0.45 μm滤膜，滤液待测。
3 结果与讨论
3.１ 样品提取剂的选择
烟碱类农药属于极性物质，易溶于甲醇、乙腈等，本实验以乙腈、乙酸乙酯为溶剂进行了提取剂的优化。实验结果表明，用乙腈提取样品，烟碱类农药的回收率大于80.2%；用乙酸乙酯提取样品，噻虫嗪的回收率只有58.7%。因此，本实验选用乙腈为提取剂。为了更好地保证乙腈渗入茶叶体内，可先加少量水浸润茶叶样品，使其恢复到鲜品状态，再均质，可提高提取效率。
3.２ 固相萃取小柱的选择
采用单一的液2液萃取方法处理样品，色谱图显示背景干扰大。固相萃取小柱（SPE）利用固体吸附剂吸附样品中的目标化合物，再用洗脱液洗脱，达到分离和富集目标化合物的目的，有效地净化样品。本实验考察了3种常用固相萃取小柱(MCX、Oasis(HLB) 和C18)对样品中烟碱类农药残留的净化效果。加入烟碱混合标准溶液之后，用不同比例的甲醇水溶液，负压抽干小柱，再用甲醇洗脱。分别用5 mL V（甲醇）∶V（水）＝1∶9、5 mL V（甲醇）∶V（水）＝2∶8、 5 mL V（甲醇）∶V（水）＝3∶7、 5 mL V(甲醇)∶V（水）＝4∶6、 5 mL V（甲醇）∶V（水）＝5∶5混合溶液依次洗涤Oasis(HLB)和C18固相萃取小柱，分别收集洗液，直接用LC2MS/MS检测，结果见图2。显示Oasis(HLB) 和C18在用V（甲醇）∶V（水）＝2∶8混合溶液淋洗时约有35%呋虫胺被洗脱下来。小柱抽干后,再用6 mL甲醇洗脱；MCX依次用5 mL 水和2%甲酸溶液淋洗,烟碱类农药被保留在小柱上，小柱抽干后,再用6 mL 5% NH3·H２Ｏ2甲醇和6 mL甲醇洗脱，MCX和Oasis(HLB)固相萃取小柱回收率高, 但MCX需要NH3·H２Ｏ2甲醇和6 mL甲醇才能全部洗脱，操作繁琐,而且在实际样品检测时发现样品添加回收不稳定,因此本实验选用Oasis(HLB)柱。
图１ 不同比例甲醇2水混合溶液淋洗Oasis(HLB)(A)和C18 (B)的烟碱回收率（略）
Fig.１ Recoveries of neonicotinoid pesticides with different ratio methanol2water Oasis(HLB)(A) and C18 (B)
1. 呋虫胺(dinotefuran); 2. 噻虫嗪(thiamethoxam); 3. 噻虫胺(Clothianidin); 4. 吡虫啉(imidacloprid); 5.啶虫咪(aAcetamiprid); 6.噻虫啉(thiacloprid)。
由于茶叶样品含有大量的色素，单独选用Oasis(HLB)柱层析净化，洗脱液中仍有植物色素存在，污染色谱柱，缩短色谱柱使用寿命。本实验通过使用活性碳和Oasis(HLB)柱净化，大量色素被活性碳吸附，提高了样品净化效果。
3.３ 流动相的选择
在高效液相色谱分析中，流动相的选择对待测物质的峰形、分离度和灵敏度有很大影响。文献[4～6]分离吡虫啉的流动相一般呈酸性，本实验选择甲醇20.15%甲酸混合溶液、乙腈20.15%甲酸混合溶液为流动相。采用乙腈20.15%混合甲酸溶液为流动相时，各组分保留时间在5.0～9.5 min之间；采用甲醇20.15%甲酸混合溶液为流动相时，各组分保留时间为7.0～9.5 min之间，各组分未完全分离（见图２）。
图２ 采用不同流动相烟碱混合标准品溶液总离子流图（略）
Fig.２ Total ion current chromatograms of neonicotinoid standards solution with different mobile phase
A. 乙腈20.15%甲酸溶液（acetonitrile20.15% formic acid）； B. 甲醇20.15%甲酸溶液（methanol20.15% formic acid） 1～6峰同图１（1－6 peaks are the same as in Fig.１）。
3.４ 方法的线性关系和检出限
分别采用流动注射的方式在正离子模式下进行6种烟碱农药标准溶液母离子全扫描,再对其子离子进行全扫描,选择信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定量离子对，各烟碱类农药的子离子全扫描质谱图见图３。
图3 呋虫胺(A)、噻虫嗪（B）、噻虫胺（C）、吡虫啉(D)、啶虫咪(E)、噻虫啉(F)、吡虫啉2D4(G)的子离子全扫描质谱图（略）
Fig.3 Full scan product ion spectra of dinotefuran(A)，thiamethoxam（B），clothianidin（C）, imidacloprid(D), acetamiprid(E), thiacloprid(F) and imidacloprid2D4(G)
用空白样品制备样品空白提取液，作为标准溶液的稀释溶液，混合标准溶液浓度分别为4、5、10 、50和100 μg/L。6种烟碱类农药残留物浓度与对应的峰面积比值呈现良好的线性关系(见表2)。方法的定量限均为0.02 mg/kg。
表2 离子对、线性方程、相关系数（略）
Table 2 Ion2pair linears equation, correlation coefficient
3.5 样品基质效应的消除
液相色谱串联质谱法测定药物残留时，有时基质对离子对具有增强或抑制效应。尽管烟碱类农药均用吡虫啉2D4作为内标，但检测茶叶复杂基质时仍然存在基质效应,用样品空白提取液作为标准溶液的稀释溶液，可使标准和样品溶液具有同样的离子化条件，从而消除了样品基质效应。本实验以空白茶叶添加0.02 mg/kg烟碱类农药标准溶液测定结果为例,标准曲线是以溶剂配制标准工作液计算，噻虫嗪、啶虫咪添加回收分别为22.2%和68.5%，其余烟碱类农药添加回收91％～118％；以样品空白提取液配制工作液计算，噻虫嗪和啶虫咪添加回收分别为96.6%和100%，其余烟碱类农药添加回收103％～106％。
3.6 方法回收率及精密度实验
选用不含6种待测组分的绿茶样品，添加0.02、0.04 和0.2 mg/kg进行回收实验,每个浓度水平取6个平行样，方法的总体回收率为80.1%～106.1%；方法的总体水平相对标准偏差为2.7%～9.7%。
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