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【摘要】 以万古霉素（vancomycin）毛细管柱为手性分离色谱柱，采用CLC和pCEC方法，对比索洛尔、阿替洛尔、克仑特罗和特布他林进行了手性拆分研究。在CLC方法中，上述4种物质均在甲醇/异丙醇/三乙胺/冰醋酸 (60/40/0.05/0.1,V/V)条件下获得最大分离，分离度（Rs）分别为1.9、1.4、1.1和0.9。在pCEC方法中，采用极性有机模式时，Rs分别为1.9、1.4、1.5和1.5；采用反相模式时，Rs分别为2.0、1.7和1.2，而特布他林则未获分离。该方法能有效拆分比索洛尔、阿替洛尔、克仑特罗和特布他林，而且CLC、pCEC极性有机模式和pCEC反相模式之间有着较强的互补关系。
【关键词】 毛细管液相色谱 加压毛细管电色谱 万古霉素 比索洛尔 阿替洛尔 克仑特罗 特布他林
1 引言
与常规液相色谱相比，毛细管液相色谱（CLC）和加压毛细管电色谱(pCEC)由于具有消耗低、污染小、样品用量少、分析速度快、易于与其它检测方法在线联用等优点，在医药、生化、环境等领域发挥了重要作用[1～3]。其中CLC可以看作是微柱化的高效液相色谱（HPLC）[4]，相比于常规手性柱，它可以节省大量昂贵的手性固定相；而pCEC则是近１０年来刚发展起来的一种新型高效的微柱分离分析技术，它结合了毛细管电泳（CE）和高效液相色谱（HPLC）的优点，具有选择性好和分离柱效高的特点[5，6]。目前它们在手性拆分中的应用越来越受到人们关注 [7～10]。
在已开发应用于毛细管柱的手性固定相中，大环糖肽类抗生素中的万古霉素被认为是非常有潜力的一种手性固定相。自1994年Armstrong[11]首次报道了以万古霉素为手性添加剂并采用毛细管电泳技术进行手性药物拆分以来，人们对万古霉素在手性拆分中的应用进行了深入研究，使得它的分离潜能得到了进一步的发挥[12～14]。从结构上来看，它含有３个疏水腔和多个手性识别位点, 这些作用部位能与被拆分物质发生多种不同的相互作用，如疏水包合作用、氢键氢键、偶极偶极、ππ电荷转移作用等。
本研究利用万古霉素为手性固定相，分别采用毛细管液相色谱（CLC）和加压毛细管电色谱（pCEC)拆分比索洛尔、阿替洛尔、克仑特罗和特布他林（结构见图1），获得了满意结果。
图1 ４种化合物的化学结构（略）
Fig.1 Structure of four studied compounds
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
TriSepTM2010GV毛细管电色谱系统（包括双泵、紫外检测器、色谱处理软件，美国通微公司）；万古霉素键合硅胶手性毛细管柱（有效长度185 mm×100 μm i.d.×375 μm O.D., 上海通微公司）；DU 640紫外扫描仪（美国Beckman公司）。
比索洛尔、阿替洛尔、克仑特罗、特布他林（购自中国药品生物制品检定所），甲醇和异丙醇为HPLC级；冰醋酸和三乙胺为分析纯；水为重蒸水。
2.2 实验方法
称取各样品适量，分别加甲醇溶解后用0.44 μm偏氟膜过滤作为贮备液，进样前用流动相稀释成40 mg/L的溶液, 取1 μＬ进样。
经紫外扫描确定比索洛尔和阿替洛尔吸收波长为230 nm、特布他林和克仑特罗吸收波长为220 nm。
3 结果与讨论
3.1 比索洛尔、阿替洛尔、克仑特罗、特布他林对映体的CLC拆分
在最佳实验条件下，比索洛尔、阿替洛尔、克仑特罗、特布他林的CLC拆分结果见表1和图2。从结果来看，比索洛尔得到了较好分离，阿替洛尔接近基线分离，而克仑特罗、特布他林仅获得部分分离。
表1 4种化合物的CLC手性拆分结果（略）
Table 1 Results of chiral separation of four compounds by capillary liquid chromatography (CLC)
注（note）：流动相为甲醇/异丙醇/三乙胺/冰醋酸（mobile phase was methanol/ isopropanol/ triethylamine/ acetic acid） (60/40/0.05/0.1, V/V)；流速（flow rate）0.02 mL/min; k1． 第一个对映体的保留因子（retention factor of the first eluting enantiomer）; k2． 第二个对映体的保留因子（retention factor of the second eluting enantiomer; α分离因子（separation factor）; N1． 第一个对映体的理论板数（theoretical plate of the first eluting enantiomer）; N2． 第二个对映体的理论板数（theoretical plate of the second eluting enantiomer）; Rs． 分离度（resolution）。
图2 ４种化合物的CLC色谱图（略）
Fig.2 Chromatograms for the enantiomeric separation of four compounds on vancomycin capillary column by CLC
a. 比索洛尔（bisoprolol)； b. 阿替洛尔（atenolol）； c. 克仑特罗(clenbuteral); d. 特布他林（terbutaline）。
3.1.1 流动相中有机改性剂及其与甲醇的比例对CLC手性分离的影响 参照文献[9]使用甲醇三乙胺冰醋酸为流动相，发现这４种化合物未能获得分离，于是考虑在流动相中添加适量其它有机溶剂，选择乙腈、乙醇、异丙醇作为有机改性剂进行比较。结果发现，添加适量异丙醇后能明显改善两对映体的分离度。同时比较了不同比例的甲醇异丙醇的分离结果（见表2）。由表2可知，随着异丙醇浓度的增加，４种化合物的分离度均得到了改善。当甲醇异丙醇比例达70∶30时，４种化合物的分离度达最大。克仑特罗、特布他林的柱效明显增加，但比索洛尔和阿替洛尔的柱效下降。当异丙醇浓度继续增加时，比索洛尔、克仑特罗、特布他林的分离度不再增加，而阿替洛尔的分离度则略有下降，且柱效明显下降。
表2 甲醇与异丙醇比例对分离度影响（略）
Table 2 Effect of the ratio of methanol and isopropanol on chiral separation
注（note）：三乙胺和冰醋酸在流动相中比例均为0.1％ (the content of triethylamine and acetic acid was 0.1% in mobile phase); 空白处表示未在该条件下进行实验(the white spaces mean the samples not analyzed)。
3.1.2 流动相中三乙胺和冰醋酸含量对分离度的影响 在甲醇/异丙醇/冰醋酸（60/40/0.1）条件下，考察了流动相中三乙胺含量对分离度的影响。三乙胺为强碱，一般认为它可以与万古霉素手性固定相之间产生氢键和偶极作用，并可以改变手性固定相表面的电荷，使手性固定相上的酚羟基和羧基电离，氢键作用减弱，可能影响分离度变化。结果发现，当三乙胺含量为0.05%时,各化合物能获得最佳分离效果。
在甲醇/异丙醇/三乙胺（60/40/0.05，Ｖ／Ｖ）条件下，对冰醋酸含量进行考察。结果显示，当流动相中添加0.1％冰醋酸时，各化合物的分离效果最好。这可能是冰醋酸量增加时，万古霉素手性固定相上的羟基和羧基被质子化，所带负电荷减少，使得静电力减弱同时氢键作用点增加，使分离度略有增加。当酸的含量进一步增加，手性固定相上的氨基也可能被质子化而带正电荷，增加了手性固定相与质子化溶质的静电排斥力，反而使分离度降低。
3.2 比索洛尔、阿替洛尔、克仑特罗和特布他林对映体的pCEC极性有机模式拆分
阿替洛尔、比索洛尔、克仑特罗和特布他林pCEC极性有机模式拆分结果（见表3和图3）。从结果来看，在各自最佳条件下，采用pCEC极性有机模式基本能实现这４种化合物的基线分离。
图3 极性有机模式下４种化合物的pCEC色谱图（略）
Fig.3 Chromatograms for the enantiomeric separation of four compounds in polar organic mode by presurized capillary electrochromatography (pCEC)
a～d. 同图2(are same as in Fig.2)。
表3 极性有机模式下４种药物的pCEC手性拆分结果（略）
Table 3 Ｒesults of chiral separation of four studied drugs in polarorganic mode by presurized capillary electrochromatography (pCEC)
注（note）：甲醇/异丙醇/三乙胺/冰醋酸（methanol /isopropanol /triehylamine /acetic acid）(Ｖ／Ｖ)：A: 60∶40∶0.05∶0.1；B: 80∶20∶0.05∶0.1；C: 50∶50∶0.05∶0.1；D: 50∶50∶0.1∶0.1；流速(flow rate) 0.02 mＬ/min；电压(voltage) －10 kＶ。
3.2.1 流动相中有机改性剂及其与甲醇的比例对极性有机pCEC手性分离的影响 选择乙醇、异丙醇、乙腈作为有机改性剂，结果发现，在甲醇中添加异丙醇后，各化合物对映体分离效果的改善最为明显。考察了甲醇和异丙醇比例对４种化合物分离度的影响。从表4中可以看出，在pCEC条件下，甲醇和异丙醇比例对各化合物的影响比较复杂。比索洛尔在甲醇异丙醇(60∶40)条件下获得较好分离；阿替洛尔则在80∶20到60∶40之间均取得相同分离度。但是到50∶50时，分离度反而略有下降。克仑特罗和特布他林均在50∶50时能获得较大分离度。
表4 甲醇和异丙醇比例对分离度影响（略）
Table 4 Effect of the ratio of methanol and isopropanol on chiral separation
注（note）： 三乙胺和冰醋酸在流动相中比例均为0.1％（the content of triethylamine and acetic acid was 0.1% in mobile phase）；电压为-10 kV(the applied voltage was -10 kV)；空白处表示未在该条件下进行实验(the white spaces mean the samples not analyzed).
3.2.2 流动相中冰醋酸和三乙胺比例对手性分离的影响 在甲醇/异丙醇/冰醋酸（80∶20∶0.1,V/V）和甲醇/异丙醇/三乙胺（50∶50∶0.1, V/V）条件下分别考察了不同添加量冰醋酸（0.01%～0.2%）对比索洛尔、阿替洛尔和对克仑特罗、特布他林分离度的影响。结果显示，流动相添加了0.1%冰醋酸，各种化合物的分离度达到最大。在甲醇/异丙醇/冰醋酸（80∶20∶ 0.1,V/V)和甲醇/异丙醇/冰醋酸（50∶50∶0.1, V/V）条件下,分别考察了不同添加量TEA（0.01%～0.2%）对比索洛尔、阿替洛尔和对克仑特罗、特布他林分离度的影响。结果表明， 三乙胺含量对4种化合物分离度的影响相对较为复杂。当流动相中添加0.05%三乙胺后，比索洛尔、阿替洛尔、克仑特罗能获得最大分离度，而特布他林则需要添加0.1%的三乙胺。
3.2.3 电压、流速对手性分离的影响 在甲醇/异丙醇/三乙胺/冰醋酸（80∶20∶0.05∶0.1, V/V）条件下，电压对阿替洛尔分离度的影响进行了考察，另外在50∶50∶0.05∶0.1(V/V)条件下,电压对克仑特罗分离度的影响也进行了考察。结果发现,电压在阿替洛尔的拆分中基本无影响，而在克仑特罗的拆分中-10 kV时显示有较好的分离度，但是总的来说，电压因素在手性拆分中影响相对较小。在上述流动相两种比例和-10 kV条件下，分别考察了流速对阿替洛尔和克仑特罗对映体手性拆分的影响.结果发现,在一定范围内（0.01～0.1 mL/min），流速对分离度基本无影响。
3.3 比索洛尔、阿替洛尔、克仑特罗和特布他林对映体的pCEC反相模式拆分
阿替洛尔、比索洛尔、克仑特罗和特布他林pCEC反相模式拆分结果, 见表5和图4。结果表明，相比于CLC和pCEC极性有机模式，在pCEC反相模式中比索洛尔和阿替洛尔的分离度分别提高到2.0和1.7，而特布他林则未获分离。
图4 反相模式下４种化合物的pCEC色谱图（略）
Fig.4 Chromatograms for the enantiomeric separation of four compounds in reversed phase mode by pCEC
a～d. 同图2(are same as in Fig.2)。
表5 反相模式下４种化合物的pCEC手性拆分结果（略）
Table 5 Results of chiral separation of four compounds in reversedphase mode by pCEC
注（note）：0.05%三乙胺冰醋酸缓冲液(buffer of triethylamine （TEAA） and acetic acid) (pH 7.0)∶甲醇（methanol）（10∶90, V/V）；-10 kV；0.02 mL/min.
3.3.1 三乙胺醋酸盐（TEAA）溶液MeOH比例对分离度影响 在0.1％TEAA溶液（pH 8.0）,-10 kＶ条件下，考察了TEAA溶液MeOH比例对分离度影响（见表6）。结果发现，随着甲醇比例的提高，比索洛尔、阿替洛尔、克仑特罗的分离度也随之提高，在0.1％TEAA甲醇（10∶90, Ｖ/Ｖ）条件下三者不仅能获得较好分离度，而且柱效也较高。但是特布他林始终未获分离。
表6 （略）
注（note）：0.1％TEAA(pH 8.0)MeOH；电压(voltage) -10 kV；流速(flow rate) 0.02 mL/min.
3.3.2 TEAA溶液pH值对分离度影响 在0.1％TEAA溶液甲醇（10∶90,V/V），-10 kV条件下考察了TEAA溶液的pH值对4种化合物分离度的影响。结果表明，在pH 4～7之间时，随着pH值升高，比索洛尔、阿替洛尔、克仑特罗的分离度有所提升，但是当pH为8.0时，比索洛尔的分离度反而略有下降。pH 7.0时分离效果最好。但是特布他林在这些条件下始终未能得到分离。pH 7.0处于万古霉素等电点附近（pH 7.2），此时万古霉素手性固定相部分羟基可能被质子化，所带负电荷减少，使得静电力减弱同时氢键作用点增加，因此使分离度有所增加.但是当pH进一步降低时，万古霉素手性固定相上的氨基也可能被质子化而带上正电荷，增加了手性固定相与质子化溶质间静电排斥力，使分离度降低。
3.3.3 电压和TEAA浓度对分离度影响 在0.1％TEAA(pH 7.0)甲醇（10∶90）条件下考察电压对4种化合物分离度的影响。结果发现，电压对分离度有影响，但是影响较小。在TEAA溶液(pH 7.0)甲醇（10∶90）,-10 kV条件下考察了TEAA浓度对4种化合物分离度的影响。结果发现，当TEAA浓度为0.05％时，比索洛尔、阿替洛尔、克仑特罗能获得较好分离度，但是特布他林未得到分离。
3.4 3种分离模式的比较
对4种手性药物在3种分离模式下测得的分离度、理论板数和容量因子进行比较，结果如图5所示。
图５ 4种药物在3种分离模式下的分离度(a)，柱效（b）和容量因子（c）比较（略）
Fig.５ Comparison of resolution (a) , theorelical plate (b) and capacity factor (c) of four drugs under three separation modes
（◆) 比索洛尔（bisoprolol）； (■)阿替洛尔（atenolol）； (▲) 克仑特罗（clenbuteral）； (×)特布他林(terbutaline)。
在手性分离时，当环境温度处于20～30℃内，它对各化合物的分离度和柱效基本无影响。在CLC、pCEC极性有机模式和pCEC反相模式下，流动相中甲醇的比例是影响拆分的主要因素。pCEC与CLC模式的最大区别是在pCEC中甲醇比例的改变将使流动相的导电性能发生变化。在电压的作用下使电流产生变化，导致各样品的分离性能产生进一步改变。因此，CLC和pCEC模式下对映体的分离情况存在着较大差异。Yao[9]等通过对卡替洛尔、赛利洛尔的研究发现，相比于CLC，采用pCEC后不仅能改善各化合物的分离度，还能提高柱效。本研究的实验结果基本上能证实上述这种观点。图5b和图5c显示，在反相pCEC模式下，4种药物的理论板数和容量因子明显提高，尤其是柱效，高于CLC模式和极性有机模式2～4倍。
本研究的4种药物分别属于芳氧丙醇胺类和苯乙醇胺类，比较3种分离模式下的手性拆分结果，芳氧丙醇胺类药物比索洛尔和阿替洛尔的两对映体分离较苯乙醇胺类药物克仑特罗和特布他林容易。而同一结构类型药物的对映体分离情况大致相近。文献[15]采用万古霉素手性固定相时，在极性有机模式下对映体选择性显著优于反相模式。这与本实验得到的苯乙醇胺类药物的分离结果是一致的。但观察芳氧丙醇胺类药物的分离结果，并非所有药物均如此。惠方民等[16]认为这主要是不同模式下占主导地位的手性识别作用不同引起的。在反相模式下，主要通过被分离化合物与万古霉素手性固定相中疏水环的疏水作用和氢键作用以及被分离化合物与万古霉素手性固定相中的自由胺基间的电荷或静电相互作用而达到分离的；而在极性有机模式下，被分离化合物与万古霉素手性固定相之间的作用主要是氢键和ππ相互作用。根据三点手性识别作用原理，在反相模式下提高了芳氧丙醇胺类药物与CSP的氢键作用力，从而使得两个对映体的分离度要稍高于极性有机模式。在极性有机模式中，苯乙醇胺类药物的分离度明显优于反相模式，显示其与CSP的作用，占主导地位的可能是ππ相互作用。以上结果也反映了反相模式下氢键作用力可能是手性识别的主要作用力，而极性有机模式下氢键并不占优势。
采用这3种分离模式，还分别对美托洛尔、赛利洛尔、班布特罗、佐米曲普坦及氟西汀对映体的手性拆分进行了研究。其中美托洛尔、赛利洛尔属于芳氧丙醇胺类药物，班布特罗属于苯乙醇胺类药物，而佐米曲普坦、氟西汀可以看作与模型药物不同类型的手性药物。结果在3种分离模式下，这些药物均实现了部分分离或全部分离，显示了该方法具有较好的适用性。
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