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【摘要】 目的：建立反相高效液相色谱法测定维生素K1冻干乳中药物含量。方法：冻干乳重建后用异丙醇破乳。采用Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇∶无水乙醇（70∶30）为流动相，检测波长为254 nm，流速为1.0 mL/min，进样量20 μL，柱温35 ℃。结果：制剂中辅料对主药测定无干扰，维生素K1在25～250 mg/L范围内峰面积与浓度线性关系良好，平均回收率为100.99%，RSD为0.24%。结论：异丙醇破乳效果良好，且对主药测定无影响。该方法简便、迅速、准确，可用于该制剂的质量控制。
【关键词】 高效液相色谱法；维生素K1；冻干乳；含量测定
［Abstract］ Objective:To determine the content of Vitamin K1 in lyophilized emulsion by reversedphase high performance liquid chromatography.Methods:The reconstituted Vitamin K1 emulsion was mixed with isopropyl alcohol. A Hypersil BDS C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used. The mobile phase was methanoldehydrated alcohol (70∶30), the UV detector at wavelength 254 nm and the flow rate 1.0 mL/min. The injection volume was 20 μL and the column temperature 35 ℃.Results:The excipients did not interfere with the determination of Vitamin K1. The method proved to be linear within the range of 25～250 mg/L. The recovery of the assay was 100.99% and RSD was 0.24%. Conclusions:Isopropyl alcohol can play a good role in emulsion breaking, meanwhile have no impact on measurement of Vitamin K1. The method appears to be simple, speedy, accurate and can be used to control the preparation quality.
［Key words］ HPLC; Vitamin K1; Lyophilized emulsion; Determination
维生素K1为人体肝内合成凝血酶原的必需物质，可促进凝血酶原（Ⅱ因子）及其它凝血因子（Ⅷ因子、Ⅸ因子和Ⅹ因子）的前体物质羧化后转变成凝血酶原及相应因子［1］。临床常用于治疗肝硬化引起的消化道出血及新生儿与产妇维生素K1缺乏。但由于维生素K1在水中不溶，其溶液型注射剂含有增溶剂吐温80，该增溶剂易氧化，其氧化产物易引起过敏，用量较大时具有一定溶血作用 ［2，3］。将维生素K1制成冻干乳，临用前加水重建成亚纳米乳可避免现有注射液的安全性、水溶性和稳定性问题。冻干乳剂含乳化剂、冻干保护剂等成分，其含量测定则需要排除这些成分的干扰。本文建立了一种准确、简便的冻干乳中维生素K1的含量测定方法，现报道如下。
1 仪器与试药
LC2010 A型高效液相色谱仪，配备UV/Vis检测器、LCsolution色谱工作站（日本岛津）；电子天平（Sartorius）；KLupII10型超纯水机（台湾艾柯）。维生素K1冻干乳（规格：10 mg，自制）；维生素K1对照品（中国药品生物制品检定所，100156 200003）；甲醇、无水乙醇为色谱纯；其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：大连依利特Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇∶无水乙醇（70∶30）；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm，进样量：20 μL。
2.2 储备溶液和对照品溶液的配制
精密称取维生素K1对照品适量，加异丙醇制成每毫升中含维生素K1 1 000 μg的溶液，摇匀，过滤，取续滤液作为储备液。将储备液以异丙醇稀释10倍作为对照品溶液（100 mg/L）。
2.3 供试品溶液的制备
精密量取维生素K1冻干乳适量（相当于维生素K1 10 mg），加水重建成乳状液，置于100 mL容量瓶中，加异丙醇破乳并稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
2.4 系统适应性试验
在上述色谱条件下，取对照品溶液（100 mg/L）及供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。维生素K1的保留时间为8.7 min，与相邻成分能完全分离（R>1.5）。以药物峰计算色谱柱的理论塔板数为7 259。按处方比例及工艺条件制备不含维生素K1的阴性空白冻干乳，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法处理样品，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，处方中辅料不干扰测定。色谱图见图1。
2.5 标准曲线的制备
精密量取储备液适量，加异丙醇稀释制成25、50、100、150、200、250 mg/L的系列浓度溶液；分别精密吸取20 μL进样，记录峰面积；以药物浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得回归方程：Y=3.81×104X-2.74×104，r2=0.9998，维生素K1在25～250 mg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系，可采用外标一点法测定药物含量。
2.6 定量限与检测限
取对照品溶液逐级稀释成适当浓度，吸取20 μL进样，使其主药峰高为噪音峰高的3倍，对应浓度作为其最低检出浓度，并计算得出其最低检出量为25.15 ng。将对照品溶液逐级稀释成适当浓度，吸取20 μL进样，使其主药峰高为噪音峰高的10倍，对应浓度作为其定量限浓度，并计算其定量限为50.30 ng。
2.7 精密度试验
取同一批号下维生素K1冻干乳制剂，按“2.3”项下制成100 mg/L供试品溶液6份，各取20 μL进样，记录维生素K1色谱峰面积，计算峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.02 %，表明本法精密度良好。
2.8 稳定性试验
取对照品溶液（100 mg/L）置于室温下，分别于0、1、2、4、6、8、12 h注入液相色谱仪，记录主峰面积，计算RSD为0.28 %，表明维生素K1溶液在室温放置12 h内稳定。
2.9 回收率试验
取空白冻干乳，分别加入维生素K1约8、10、12 mg，按照供试品溶液制备项下方法操作，制得不同含药量的维生素K1破乳液，每个浓度配制3份，分别进样20 μL，测定峰面积，代入标准曲线换算成实际测定量，计算回收率，结果见表1。表1 回收率测定结果
2.10 含量测定
取维生素K1冻干乳样品3批（批号：07010801、07010802、07010809），照“2.3”项下方法进行操作，得供试品溶液；另取对照品适量，照“2.2”项下方法进行操作，得对照品溶液。分别取供试品溶液与对照品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积，按外标法计算即得。3批样品的含量测定结果为：104.38%±0.50%、103.38%±0.24%、102.68%±0.42%。
3 讨论
冻干乳中由于有冻干保护剂糖类物质的存在，有机溶剂破乳时不能将其溶解，呈浑浊状态。实验中发现，先用水将维生素K1冻干乳重建呈乳状液后再进行破乳，能获得适于高效液相色谱仪分析的澄清溶液。
常用的破乳方法有甲醇、乙醇、异丙醇等破乳法［46］，实验发现甲醇及乙醇对本样品破乳不完全，而异丙醇对主药及乳化剂磷脂溶解能力强，破乳效果好，因此实验中选用异丙醇为维生素K1冻干乳的破乳剂。本文所建方法样品处理操作简单，灵敏度较高，适用于维生素K1冻干乳剂的含量测定。
【参考文献】
［1］ Laura YW,Chris JB,Liya Y,et al. Determination of phylloquinone (vitamin K1) in plasma and serum by HPLC with fluorescence detection ［J］. Clinica Chimica Acta, 2004，347(12): 199207.
［2］ 陈兰贞. 静脉滴注维生素K1不良反应的观察和护理［J］. 医学理论与实践, 2007, 20(1): 109110.
［3］ 姜红英. 小儿静脉注射维生素K1致过敏反应一例［J］. 儿科药学杂志, 2007, 13(1): 48．
［4］ 李 欣, 刘 燕, 康艳敏, 等. 高效液相色谱法测定多西紫杉醇静脉纳米乳的含量［J］. 解放军药学学报, 2007, 23(1): 3234.
［5］ 汪晓凌, 李竹芬, 陈燕忠, 等. 高效液相色谱法测定多西紫杉醇酯质体药物含量及包封率［J］. 广东药学院学报, 2006, 22(5): 513515.
［6］ 蒋智清, 林友文, 陈兰姝. 氟尿嘧啶微球体外释药的影响因素［J］. 福建医科大学学报, 2006, 40(4): 364367.