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【摘要】目的建立夏枯草的高效液相色谱法（HPLC）的分析方法，研究不同产地夏枯草中熊果酸的含量差异。方法色谱柱为迪马钻石Diamonsil C18分析柱(4．6 mm×250 mm×5 μm)；流动相为0．04 mol／L磷酸二氢钠∶乙腈(体积比为20∶80)；检测波长210nm；柱温35℃。结果不同产地资源的夏枯草药材中熊果酸含量有明显的差异, 其中以四川峨眉产的夏枯草中熊果酸含量最高，其次为浙江磐安产的。结论该结果可为评价不同产地夏枯草药材质量，为选育出夏枯草的优良品种提供依据。
【关键词】 高效液相色谱 夏枯草 熊果酸
夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris L．的干燥果穗。味苦、辛寒，有清火、明目、散结、消肿等功效［1］。 夏枯草主要含有三萜及其苷类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素、有机酸、挥发油及糖类等成分。具有降压、降糖、抗菌、抗炎、抗过敏及抗病毒等作用［2，3］，在我国主产于湖南、安徽、浙江、江苏。本实验采用HPLC法同时测定不同产地夏枯草中熊果酸含量，通过比较不同产地夏枯草的质量，为合理利用该药用植物资源及评价不同产地夏枯草的质量提供依据。
1 仪器与试药
Aglient HP1100 高效液相色谱仪(安捷伦)，二极管阵列检测器(DAD)；熊果酸对照品购自中国药品生物制品检定所，乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。夏枯草药材分别从浙江景宁、浙江磐安、四川南充、四川峨眉、浙江乐清、重庆彭水、重庆南川采集或收集，经鉴定为唇形科植物夏枯草的干燥果穗。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱为迪马钻石Diamonsil C18分析柱(4．6 mm×250 mm×5 μm)；流动相为0.04 mol/L磷酸二氢钠（用5%磷酸调节pH至2.80）∶乙腈(体积比为20∶80)；流速1.0 ml/min；检测波长210 nm；柱温35℃；进样量20 μl。
2.2 样品液的制备
2.2.1 标准溶液的配制称取熊果酸标准样品2.57 mg，置于25 ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得含熊果酸0.102 8 mg／ml的标准溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备称取样品粉末（过2号筛）2 g，精密称定，置索氏提取器中，加入乙醚50 ml，浸泡过夜，加热回流6 h，蒸干溶剂，残渣用甲醇溶解并转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度。精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系考察 精密吸取该对照品溶液2，5，10，15，20，25，30，40 μl， 按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，熊果酸进样量为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程：Y = 542.626 3X -7.214 3，相关系数r=0.999 98。表明熊果酸在0.2～40 μg范围内具有良好的线性关系。
2.3.2 精密度实验精密吸取熊果酸对照品溶液，重复进样5次，20μl,考察测定的精密度，熊果酸峰面积积分值分别为1 096.6，1 092.8，1 089.9，1 107.5，1 100.1。平均值为1 097.38，相对标准偏差为0.62％。
2.3.3 重复性实验取同一批号的夏枯草6份，依上述条件测定含量，样品熊果酸含量分别为2.519 7%，2.489 6%，2.704 7%，2.659 5%，2.667 8%，2.613 2%，相对标准偏差为3.32%，表明方法的重复性较好。
2.3.4 稳定性实验取同一标准品溶液，室温下放置，分别在0，24 h进样20 μl测定，熊果酸峰面积积分平均值分别为1 095.9，1 097.4。表明样品溶液在室温下比较稳定。
2.3.5 加样回收率实验取已知含量的夏枯草样品，分别添加熊果酸对照品后，同上述条件，进行测定。结果见表1。
表1 加样回收率实验结果（略）
2.3.6 样品测定 按上述条件测定所采集自浙江、重庆、四川等地的夏枯草样品中熊果酸含量。结果见图1～2及表2。
图1 对照品HPLC图（略）
图2 样品HPLC图（略）
3 讨论
3.1 提取条件的选择实验中以熊果酸的含量作为考察指标，筛选并确定最佳提取方法，比较不同提取溶剂（甲醇、乙醇、乙醚）索氏提取、不同提取时间（2，4，6，8 h）对熊果酸含量的影响。结果表明，以乙醚为溶剂提取效果最好，6 h已基本提取完全，故采用乙醚索氏提取6 h。
表2 不同产地夏枯草中的熊果酸含量（略）
3.2 流动相的选择 曾考察了用甲醇作流动相，但熊果酸峰与杂质峰不能分离，所以改作乙腈作流动相。曾用不同比例的乙腈与水作流动相，但峰形不佳，可能是熊果酸有部分解离的缘故。所以改用0．04 mol/L磷酸氢二钠，用5%磷酸调pH值，用pH值分别为2.6，2.7，2.8和2.9等4种缓冲盐溶液，在pH 2.6和2.7两种条件下，表现为基线不稳，噪声大，而2.8与2.9两种pH值条件下，又以pH为2.8时峰形较好，熊果酸的保留时间为21.9 min。
《中国药典》2005年版Ⅰ部夏枯草项下规定，按干燥品计算，原药材含熊果酸的总量不得少于 0.12％［1］。从上述测定结果可见，所选不同产地的药材均符合《中国药典》标准。但是不同商品夏枯草中有效成分含量差异显著，四川峨眉产的夏枯草中，熊果酸含量最高，四川南允熊果酸含量最低。分析主要影响因素可能是不同遗传基础和生态环境（光照、气候、土壤）的不同所致。所以加强药材来源管理和对药材质量控制是很有必要的。该研究结果为评价不同产地夏枯草质量提供了科学依据。
【参考文献】
［1］ 国家药典委员会．中国药典，Ⅰ部［S］．北京：化学工业出版社，2005：178.
［2］ 李传健，王厚龙，孙桂林，等.夏枯草药用及栽培技术［J］.人参研究，2006，3：44.
［3］ 孙维广，廖慧丽，叶志明，等．夏枯草化学及药理研究概况 ［J］．中国中医药信息杂志，2003，10(8)：86.