高效液相色谱法测定杜仲愈伤组织和悬浮细胞中绿原酸

　　【摘要】 　　目的建立高效液相色谱法测定杜仲愈伤组织和悬浮细胞中绿原酸含量。方法利用Hypersil C18-ODS柱(250 mm×4.6 mm， 5μm)色谱柱，乙腈-水-磷酸溶液(12∶87.9∶0.1)为流动相，检测波长为327 nm，流速1.0 ml/min，柱温为25℃。结果绿原酸在2.216～55.4 μg/ml范围内线性关系良好，r=0.998 1，愈伤组织和悬浮细胞中绿原酸的平均加样回收率分别为100.69%和97.62%，RSD分别为2.42%和2.71%。结论该方法快速简便，准确可靠。杜仲愈伤组织和悬浮细胞中绿原酸含量分别为1.528 mg/g和3.949 mg/g。

　　【关键词】  杜仲 愈伤组织 悬浮细胞 绿原酸 高效液相色谱法

　　Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of chlorogenic acid in callus and suspension cells of  Eucommia ulmoides Oliv. MethodsThe separation was performed on Hypersil C18-ODS (250mm×4.6mm，5μm) column， using acetonitrile-water-H3PO4 (12∶87.9∶0.1)as mobile phase， detected at 327 nm. The flow rate was 1.0 ml/min， the column temperature was 25 ℃.ResultsThe linear range of chlorogenic acid was 2.216～55.4 mg/ml， r=0.998 4， the average recovery of chlorogenic acid in casllus and suspension cells were 100.69% and 97.62%， RSD were 2.42% and 2.72%， respectively. ConclusionThe method is rapid， simple， accurate and stable. Chlorogenic acid content in callus and suspension cells of Eucommia ulmoides Oliv are 1.528 mg/g and 3.949mg/g respectively.

　　Key words：Eucommia ulmoides Oliv;  Callus;  Suspension cell;  Chlorogenic acid;  HPLC

　　杜仲Eucommia ulmoides Oliv为杜仲科杜仲属植物，为我国名贵中药材，具有补肝肾、强筋骨、安胎、降血压之功效［1］。近年来，我国的制药工业、保健品生产以及工业材料等方面对杜仲的需求不断增加［2］。人们为了追求短期经济效益，无计划人工砍伐开采杜仲资源，加之杜仲生长缓慢，自然环境的破坏等原因，杜仲野生资源日趋枯竭，已经不能满足人们的需要。因此除充分利用现有野生杜仲资源外，利用杜仲愈伤组织和细胞的大规模培养来获得高含量药用成分的材料提供给杜仲工业市场已成为一种发展趋势。绿原酸是杜仲中一种重要的活性成分， 具有抗菌、抗病毒、保肝、降压等药用功效，2005版《中国药典》将其量的高低定为评价杜仲药用价值的主要技术指标之一［3］。利用HPLC法测定杜仲绿原酸的研究已有大量报道［4，5］。为了配合杜仲愈伤组织和细胞培养的研究，本研究建立了测定杜仲愈伤组织和悬浮细胞中绿原酸的HPLC方法，并利用HPLC法对愈伤组织和由杜仲疏松愈伤组织建立的悬浮细胞系下培养所得的细胞中绿原酸进行了含量测定，从而为利用细胞工程方法生产绿原酸提供一定的实验依据。

　　1  材料与仪器

　　Agilent 1100高效液相色谱仪(配备四元泵，VWD检测器，真空脱气机，柱温箱)，Hpchem工作站，KQ-500DB数控超声清洗器，Sartorius万分之一电子天平，0.45μm过滤器，冷冻干燥系统。绿原酸对照品由中国药品生物制品检定所提供。杜仲愈伤组织按文献［6］方法进行诱导和继代培养，愈伤组织2周继代1次，继代3次后，将愈伤组织取出，真空冷冻干燥后供样品制备用。悬浮细胞是按考献［7］方法筛选所得疏松愈伤组织在本实验室优化所得的液体培养基下，置于摇床中进行悬浮培养所得。培养1周后，将其取出真空冷冻干燥供样品制备用。样品提取所用甲醇为分析纯，HPLC用乙腈、磷酸为色谱纯，水为三蒸水。

　　2  方法

　　2.1  色谱条件色谱柱Hypersil C18-ODS柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为乙腈-水-磷酸溶液(12∶87.9∶0.1)；检测波长为327 nm；流速1.0 ml/min；柱温为25℃；进样量为10μl，采用面积外标法。

　　2.2  对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品2.77 mg，置50 ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，得含绿原酸0.0554 mg/ml的标准溶液。分别精密吸取标准溶液0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0   ml，置于5 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。

　　2.3  样品溶液的制备精密称取杜仲愈伤组织和悬浮细胞干粉各0.2 g于置10 ml容量瓶中，准确加入50%甲醇9 ml，置超声清洗器中超声提取60 min，取出放冷至室温，摇匀，过滤，取续滤液定容到10 ml容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤即为样品溶液。

　　3  结果

　　3.1  绿原酸的色谱分析在“2.1”项色谱条件下，绿原酸标准品、杜仲愈伤组织及悬浮细胞溶液的色谱分析见图1~3。样品中绿原酸峰与其他非被测成分峰能够达到基线分离，可根据标准品洗脱峰所得保留时间确定样品溶液中绿原酸的峰。

　　图1  绿原酸标准品HPLC图谱（略）

　　图2  愈伤组织中绿原酸HPLC图谱（略）

　　图3  悬浮细胞中绿原酸HPLC图谱（略）

　　3.2  标准曲线的制备取按“2.2”项方法制备的储备液进行标准曲线的制备。每个对照品储备液进样10 μl，测定峰面积。以峰面积值（Y）为纵坐标，其对应进样质量浓度(X， μg/ml)为横坐标，进行回归计算，得线性方程为：Y=71.904X-40.479，r=0.998 1。表明绿原酸浓度为2.216～55.4 μg/ml范围内具有良好的线性关系。

　　3.3  精密度实验 精密吸取对照品溶液重复进样5次，每次10 μl ，分别测定峰面积，绿原酸峰面积的RSD(相对标准偏差)为0.8%。表明仪器精密度和进样方法良好。

　　3.4  重复性实验准确称取杜仲愈伤组织和悬浮细胞样品各5份，每份0.2  g，按“2.3”项下方法制备样品溶液，进样分析，测定绿原酸峰面积，外标法计算含量。杜仲愈伤组织和悬浮细胞样品中绿原酸含量的RSD分别为1.8%和2.4%。表明样品处理方法重复性好。

　　3.5  加样回收率实验准确称取已知绿原酸含量的愈伤组织和悬浮细胞样品各5份，每份0.2 g，分别加入适量绿原酸对照品，按“2.3项”下操作制备样品溶液，进样10 μl， 测定绿原酸含量，计算加样回收率。结果见表1和表2。

　　表1  愈伤组织中绿原酸加样回收实验结果（略）

　　表2  悬浮细胞中绿原酸加样回收实验结果（略）

　　3.6  样品测定结果根据上述条件对愈伤组织和绿原酸样品进行含量测定，每样品3份。结果见表3。绿原酸的含量在愈伤组织和悬浮细胞中有较大的差别。悬浮细胞中绿原酸的平均含量为愈伤组织中的2.6倍，说明在悬浮细胞中绿原酸的积累更有优势。

　　表3  杜仲愈伤组织和悬浮细胞绿原酸含量（略）

　　4  讨论

　　4.1  提取方法的选择目前提取杜仲中活性成分（绿原酸）主要包括超声、回流和冷浸等方法，提取相一般为水和有机溶剂［8］。本文以杜仲愈伤组织为材料对提取方法进行考察，比较了甲醇的含量及提取时间对提取效率的影响。以水、20%甲醇、50%甲醇、80%甲醇为溶剂，超声提取60 min，结果以50%甲醇为溶剂时，色谱峰分离效果最佳，而且提取完全；比较l5，30，60，90 min的超声提取效果，结果60 min时提取效率最高。

　　4.2  绿原酸测定方法的建立实验采用HPLC测定杜仲愈伤组织和悬浮细胞中绿原酸的含量，结果准确，精密度高，重复性好，平均加样回收率分别为100.69%和97.62%，RSD为2.42%和2.71%。说明该方法可用于杜仲愈伤组织和悬浮细胞规模生产中活性成分的定量分析。

　　4.3  杜仲的愈伤组织和细胞培养由于野生资源的匮乏，通过愈伤组织和细胞培养生产所需要的目标产物愈来愈引起人们的重视与关注。实验表明来源于杜仲种子诱导产生的愈伤组织和悬浮细胞都能够产生绿原酸，质量分数为1.528 mg/g和3.949 mg/g。同野生杜仲叶中报道的绿原酸相比，愈伤组织和悬浮细胞中含量还有待提高［9］。我们将进一步通过高产细胞株系的筛选和培养条件的探索与优化，使其达到或超出天然来源的含量［10，11］。利用杜仲细胞的大规模悬浮培养生产有关活性代谢产物将具有广阔的前景。

　　【参考文献】
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　　［4］ 刘圣金， 狄留庆， 吴德康， 等. 高效液相色谱法测定杜仲中绿原酸的含量［J］. 中国中医药信息杂志， 2006， 13(1): 44.

　　［5］ 石少澜， 王祝举， 邵爱娟， 等. 高效液相色谱法测定杜仲皮中绿原酸的含量［J］. 中国中药杂志， 2005， 30(9): 715.

　　［6］ 邱晓芳， 朱 笃， 张志斌，等. 杜仲愈伤组织继代培养基抑制褐化的研究［J］. 食品科学， 2007， 28(8): 307.

　　［7］ 邱晓芳， 朱 笃， 张志斌， 等. 杜仲疏松愈伤组织诱导条件的优化筛选［J］. 食品科学， 2006， 27(11): 375.

　　［8］ 刘辉琳， 唐明林， 安莲英， 等. 杜仲药用有效成分提取方法研究［J］. 天然产物研究与开发， 2002， 12(6): 47.

　　［9］ 尉 芹， 景谦平， 马希汉. 杜仲叶中绿原酸的提取工艺条件研究［J］. 林产化学与工业， 2001， 21(4): 27.

　　［10］ 唐建军， 陈 欣， 志水胜好. 培养条件对杜仲愈伤组织形成及次生代谢过程的影响［J］. 浙江大学学报(工学版)， 2002， 36(2): 193.

　　［11］ 李 琰， 张朝红， 马希汉. 培养基成分对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响［J］.武汉植物学研究， 2004， 22(4): 359.