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【摘要】 目的建立一种反相高效液相色谱方法，测定葛根、山楂、红花混合提取物中葛根素和羟基红花黄色素A的含量。方法采用Hypersil ODS 4.6 mm（i..d.）×250 mm，5μm，以0.2％（V/V）磷酸水溶液∶甲醇∶乙腈（81∶16∶3）为流动相，流速1.2 ml/min，柱温25℃，检测波长分别为250，403 nm，测葛根素和羟基红花黄色素A。结果葛根素和羟基红花黄色素A线性范围分别为0.032 406～0.162 08 mg/ml和0.029 4～0.147 mg/ml;平均加样回收率分别为98.3％，98.0％;RSD分别为1.2％，1.6％。结论该方法快速、简便、准确，可为评价该提取物的质量提供依据。
【关键词】 葛根素 羟基红花黄色素A 高效液相色谱法
Abstract：Objective：To establish an RP -HPLC method for the determination of the content of Puerarin and HSYA in the extracts from Radix Puerariae,Fructus Crataegi and Carthamus tintorius.MethodsThe HPLC system consisted of Hypersil ODS column(250 mm× 4.6 mm,id 5 μm) with phosphoric acid (0.2%):methanol :acetonitrile (81:16:3)mixture as mobile phase, the flow rate was 1.2 ml/min, the detection wavelength was 250，403 nm respectively for determination of Puerarin and HSYA, and the column temperature was 25℃. ResultsThe linearity ranges of Puerarin and HYSA were in the range of 0.032 406～0.162 08mg/ml and 0.0294～0.147mg/ml respectively, the average recoveries of adding sample were 98.3% and 98.0%,the RSD(n=5) were 1.2% and 1.6% respectively. ConclusionThe method is simple , fast and accurate. It can be used for the quality control of the extracts of Radix Puerariae, Fructus Crataegi and Carthamus tintorius.
Key words：Puerarin ; HSYA ; HPLC
脑得生方是《中国药典》经典方［1］，由三七、山楂、川芎、红花和葛根组成。葛根、山楂、红花中黄酮类成分具有抗血栓和改善脑循环的作用。本研究建立葛根山楂红花总黄酮提物含量测定方法，为进一步纯化该提取物黄酮类成分及二次开发奠定基础。
1 仪器和试药
1100型HPLC仪，含UV－VIS检测器，chemstation数据处理系统（美国Agilent公司）;BP 211D电子天平（sartorius公司）；葛根素，羟基红花黄色素A对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用）；试剂均为分析纯，甲醇（上海振兴化工一厂），乙腈（国药集团化学试剂有限公司），磷酸（武汉化学试剂厂）；实验室用水为自制双蒸水。葛根、红花、山楂提取物（实验室自制批号20070621，20070712，20070823）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Hypersil ODS 4.6 mm（i..d.）×250 mm，5μm；流动相：0.2％（V/V）磷酸水溶液∶甲醇∶乙腈（81∶16∶3）；检测波长250 nm（测葛根素），403 nm（测羟基红花黄色素A）；流速1.2 ml/min; 柱温25℃ ，进样量10 μl。
2.2 对照品溶液的制备
称取葛根素、羟基红花黄色素A适量，加40％的乙醇配成浓度分别为0.081，0.147/mg·ml-1对照品溶液，密封置冰箱保存。
2.3 供试品溶液的制备
称取提取物粉末约0.06 g，精密称定，加40％的乙醇定容至100 ml。取上述溶液适量过0.45 μm滤膜，制成供试品（测葛根素样品）; 另称取提取物粉末约0.68 g，精密称定，加40％的乙醇定容至50 ml。取上述溶液适量过0.45 μm滤膜，制成供试品（测羟基红花黄色素A样品）。
2.4 方法学考察
2.4.1 线性关系考察
葛根素线性关系：分别吸取浓度为（mg/ml）：0.032 46，0.064 862，0.009 724 8，0.129 664，0.162 08葛根素对照品溶液10 μl，进样记录色谱峰峰面积，以进样浓度（mg/ml）作为纵坐标，吸收峰面积为横坐标，得回归方程：C＝3×10-5A＋0.002 5（r＝0.999 9）。结果表明葛根素在32.406～162.08 μg/ml范围内线性关系良好。
羟基红花黄色素A线性关系：分别吸取浓度为（mg/ml）0.029 4，0.058 8，0.088 2，0.117 6，0.147羟基红花黄色素A对照品溶液10 μl，进样记录色谱峰峰面积，以进样浓度（mg/ml）作为纵坐标，吸收峰面积为横坐标，得回归方程：C＝5×10-5A＋0.002 2（r＝0.999 9）。结果表明葛根素在29.4～147 μg/ml范围内线性关系良好。
2.4.2 稳定性考察
分别精密吸取样品供试液在8 h内每隔2 h测定1次，每次进样量为10 μl，测得样品中葛根素峰面积的RSD为0.80%（n＝5）;羟基红花黄色素A峰面积的RSD为0.59％（n＝5）。
2.4.3 精密度考察
分别吸取葛根素和羟基红花黄色素A对照品溶液10 μl连续进样5次，测得葛根素峰面积的RSD为0.86％，为羟基红花黄色素A面积的RSD为0.74％。
2.4.4 重复性实验
取同一批号样品按供试品溶液的制备方法平行制备5份，按上述色谱条件进行测定，测得样品中葛根素和羟基红花黄色素A峰面积的RSD分别为0.5％，1.73％。
2.4.5 回收率实验
平行称取已知含量的提取物物粉末各5份，加入定量的葛根素，羟基红花黄色素A对照品，按照样品测定方法测定。结果表明，葛根素和羟基红花黄色素A平均加样回收率分别为98.3％（RSD＝1.2％）和98.0％（RSD＝1.6％）。
2.5 样品含量测定 按上述方法对3批提取物进行含量测定计算样品中葛根素和羟基红花黄色素A的含量。结果见表1及图1～2。表1 样品中葛根素和羟基红花黄色素A的含量（略）
3 讨论
考虑到羟基红花黄色素A和葛根素都显酸性，考察了磷酸不同浓度，结果发现0.2％磷酸水溶液分离效果好。实验室还考察了甲醇－磷酸水，乙腈－磷酸水系统，发现葛根素，羟基红花黄色素A均不能达到完全分离。由于中药复方成分复杂，采用0.2％（V/V）磷酸水溶液∶甲醇∶乙腈（81∶16∶3）三元系统洗脱，得到满意效果。
实验中尝试在同一波长下同时测定葛根素和羟基红花黄色素A，结果发现很难同时使两个成分的都有较好线性，且精密度不易同时达到要求，故采用在不同波长下分别测定。
【参考文献】
［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：572.