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【摘要】 目的延胡索乙素作为对照品，建立高效液相色谱（HPLC）法控制复方元胡止痛胶囊的质量。方法采用Alltima C18色谱柱（5μm，4.6 mm×250 mn），用甲醇-水-三乙胺（65∶35∶0.5）为流动相，检测波长280 nm；柱温30℃；流速1.0 ml/min。结果延胡索乙素含量在0.102 9～1.028 8 μg范围内呈良好线性关系，得回归方程Y＝4.840 1X +0.089 5，r=0.999 7，平均加样回收率及RSD分别为101.17%和1.02%。结论以延胡索乙素为对照品，采用HPLC法控制复方元胡止痛胶囊质量的方法简便快速、准确可靠、重复性好，专属性强。
【关键词】 复方元胡止痛胶囊；高效液相色谱； 延胡索乙素
Abstract：ObjectiveTo establish the method for determining the content of tetrahydropalmatine in complex Yuanhu Zhitong capsule by HPLC. MethodsThe separation was performed on Alltima C18 column (5μm, 4.6mm×250mm) with methanol-H2O -triethylamine (65∶35∶0.5) as mobile phase .The detection wavelength was at 280 nm, the column temperature was 30 ℃, and the mobile phase speed was 1.0ml per min.ResultsThe calibration curve was linear in the range of 0.1029 to 1.0288 μg for the tetrahydropalmatine content and the linear equation was y＝4.840 1x +0.089 5(r=0.999 7). The average recovery rate was 101.17% and the relative standard deviation was 1.02%. ConclusionThe method is simple,rapid,accurate and reproducible.It can be used for the determination of tetrahydropalmatine content complex Yuanhu Zhitong capsule.
Key words：HPLC； Rhizoma Corydalis Decumbentis； Protopine； Content determination
复方元胡止痛胶囊是由延胡索（醋制）、香附（醋制）、川楝子、徐长卿4味药组成的中药复方制剂，是在复方元胡止痛片的基础上经剂型改变而来，功能疏气止痛，可用于肝胃气痛，胃脘胀痛，胸肋痛，月经痛［1］。延胡索为方中君药，现代研究表明，其主要有效成分为生物碱，其中以延胡索乙素的镇痛作用较强，另外还有延胡索甲素（d-紫堇碱）、延胡索丙素、延胡索丁素（1-四氢黄连碱）、延胡索戊素（dl-四氢黄连碱）、黄连碱、非洲防己碱、d-海罂粟碱等［2］。为了提高产品的质量可控性，我们建立了HPLC测定样品中延胡索乙素含量的质量控制法。现报道如下。
1 器材与方法
1.1 仪器
高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)：P200 II型高压恒流泵，UV200 II 紫外可变波长检测仪，Rheodyne 7725i 高压六通进样阀，20 μl定量环；HW色谱工作站（南京千谱软件有限公司）；百万分之一电子天平（瑞士Mettler公司M3型）。
1.2 试药
复方元胡止痛胶囊（由本实验室自制）；延胡索乙素对照品（供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号0726-200208）；甲醇为色谱纯（中国医药集体上海化学试剂公司）；三乙胺（中国医药集体上海化学试剂公司）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱为Alltima C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mn）；流动相为甲醇-水-三乙胺（65∶35∶0.5），使用前用孔径为0.45 μm的有机滤膜减压过滤，超声20 min；检测波长280 nm；柱温30℃；流速1.0 ml/min；进样量10 μl。
2.2 可行性实验精密称取供试品2 g，精密加入浓氨试液-甲醇（1∶20）50 ml，称定重量，回流90 min（75℃），放冷，再称定重量，用浓氨试液-甲醇(1∶20)补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25 ml置水浴锅上蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至5 ml，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为HPLC检测的供试品溶液。取配制好的延胡索乙素对照品溶液、供试品溶液分别进样，原儿茶醛峰保留时间为9.275 min（见图1～3）。由图1～3可知，延胡索乙素保留时间为16.5 min左右，与其它组分分离很好，且阴性对照无干扰峰。理论板数以延胡索乙素计算为3 000。
2.3 线性关系的考察精密称取延胡索对照品1.286 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，浓度为0.051 44 mg/ml。从中分别精密吸取2，5，10，15，20 μl注入色谱仪，测定其峰面积，以延胡索乙素进样量为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。见图2。由图2可知，延胡索乙素在0.102 9～1.028 8μg范围内进样量与峰面积有良好线性关系，回归方程为Y＝4.840 1X +0.089 5，r=0.999 7（n=5）。
2.4 精密度实验精密吸取对照品溶液10 μl注入液相色谱仪，记录峰面积，重复测定6次，RSD为0.64%。结果见表1。结果表明精密度好。表1 精密度测定结果（略）
2.5 样品回流时间考察取本品50粒，去胶囊壳后，混匀，取约2 g（批号20040501），精密称定，称取4份，分别置平底烧瓶中，精密加入浓氨-甲醇（1∶20）50 ml，密塞，称定重量，分别回流30,60,90,120 min（75℃），放冷，再称重，用浓氨-甲醇(1∶20)补足减失的重量，摇匀，过滤，精密取续滤液25 ml置水浴锅上蒸干，残渣用甲醇溶解定容至5 ml，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。依上述的方法测定。结果见表2。由表2可知，样品回流90 min即可。表2 不同回流时间测得的延胡索乙素含量（略）
2.6 稳定性实验取供试品溶液（批号20040501），间隔一定时间进针1次，共考察12 h，测定延胡索乙素峰面积积分值，结果表明本品12 h内稳定，RSD为0.97%。结果见表3。表3 稳定性实验结果（略）
2.7 重复性实验取本品50粒（批号20040501），去胶囊壳后，称定重量，混匀，称取5份，2 g/份，精密称定，按供试品制备方法，制备供试品溶液，照样品含量测定方法测定。结果见表4。结果表明本测定方法重复性较好。表4 重复性实验结果（略）
2.8 加样回收率实验取本品已知含量，同一批号（批号20040501）样品共6份，每份约1 g，精密称定，置平底烧瓶中。另取延胡索乙素对照品用浓氨试液-甲醇(1∶20)配制成浓度为0.055 mg/ml的溶液，每份样品中精密加入50 ml此溶液，称定重量，回流90 min，放冷，再称定重量，用浓氨试液-甲醇(1:20)补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25 ml置水浴锅上蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至5 ml,用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。
照上述供试品制备方法制备供试品溶液，按含量测定方法测定延胡索乙素含量，按以下公式计算回收率。结果见表5。结果表明本法回收率较高，方法可行。表5 延胡索乙素含量测定加样回收率的实验结果（略）
2.9 样品含量测定按上述方法制备供试品溶液和对照品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，依上述色谱条件测定10批样品延胡索乙素的含量（n＝4）。结果见表6。由表可知，本品的延胡索含量为0.068 5～0.083 5 mg/粒，暂定本品每粒含延胡索乙素（C21H25NO4 ）不得少于0.05 mg。表6 样品含量测定结果（略）
3 讨论
延胡索对中枢神经系统具有明显的镇痛作用，并能使肌肉松弛具有解痉效应，口服能产生类似吗啡以及可待因的效果，能缓解一般神经痛、头痛、腰痛、关节痛、月经痛、肿疡疼痛等。延胡索乙素是延胡索生物碱中具有较强镇痛作用的成分，因此选择延胡索乙素作为控制质量标准的指标之一，有一定意义。
在原剂型复方元胡止痛片的部颁标准中，只有3个理化性质鉴别，专属性不强，也没有含量测定项，显然已经不符合我国中医药现代化的要求。本实验室在参考文献［4～6］的基础上，先后考察了不同的预处理方法与流动相，最终选用了甲醇-水-三乙胺（65∶35∶0.5）为流动相，分离效果好。方法学考察结果表明，采用HPLC法测定延胡索乙素在复方元胡止痛胶囊制剂中的含量，稳定性好、精密度高、结果可靠、专属性强，而且它是一个主要的活性成分，这样就可以更好地控制产品质量，使产品更符合我国中药现代化的要求。
【参考文献】
［1］中华人民共和国卫生部药政局.中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂，第7册［S］.
［2］中国药材公司. 中国常用中药材［S］.北京：科学出版社, 1995：289.
［3］徐婷, 金昔陆, 曹惠明.延胡索乙素药理作用的研究进展［J］.中国临床药学杂志, 2001, 10(1):58.
［4］朱才庆，范其坤，熊胜泉，等. 高效液相色谱法测定夏天无注射液中原阿片碱的含量［J］.中草药, 2005, 36(5):699.
［5］庄建红，简惠，王俊香. 延胡索中延胡索乙素含量测定提取方法的研究［J］. 时珍国医国药,1998 ,9 (5) :421.
［6］龚青，周蒂，王碧娟.HPLC 法测定延胡索中延胡索乙素的含量［J］.中国现代应用药学杂志, 2000, 17 (4) ：315.