高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体

    (一)　原理
　　根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。
　　(二)操作步骤
　　腹水10,000g离心10min，除去细胞和杂质，在4℃条件下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，
　　使终浓度为40％饱和硫酸铵
　　　　　　　　　　　　　　　　↓搅拌20～30min
　　离心，沉淀用40％饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A(PH8.5 20mM Tris缓
　　冲液)透析除盐
　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃过夜
　　用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的
　　TSK DEAE SPW离子交换层析柱
　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　洗脱流速1ml／min
　　0～1min：0→5％缓冲液B(20mM Tris, PH8.5, 含2.0M醋酸钠)
　　1～20min(线性梯度洗脱)：5→20％缓冲液B
　　20～22min：20→0％缓冲液B
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　　　　　　　　　洗脱液用紫外280nm进行监测
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　　　　　　　　收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定
　
　　(三)　试剂和器材
　　1. TSK DEAE SPW离子交换层析柱(75×7.5mm, Bio Rad)
　　2.　高效液相色谱仪(包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统)。
　　3.　PBS，缓冲液A和B
　　(四)　注意事项
　　1.　所用缓冲液和加样粗提物均需0.22μm滤膜过滤。
　　2.　在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11～12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb的存留时间(retention time)有所差异。