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【摘要】 目的首次提取柳茶中的水溶性粗多糖并进行分离、纯化及组成分析。方法柳茶经热水提取、乙醇沉淀、Sevag法去蛋白、H2O2脱色，逆向流水透析得多糖精制品。将精多糖衍生化后运用气相色谱-质谱法对其化学成分进行分析。结果确定了柳茶中水溶性多糖分别由核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，其中以核糖、葡糖糖、半乳糖为主。结论该方法简便、灵敏，可以准确测定出柳茶多糖中所含有的各种单糖。
【关键词】 柳茶多糖; 纯化; 气相色谱-质谱; 单糖
Abstract：ObjectiveTo isolate and purify the water-soluble polysaccharide from Liucha and analyze the chemical composition of liucha.MethodsThe liucha was extracted in hot water， then the polysaccharide in the filtrate was fractionally precipitated by alcohol，after that the proteins in the precipitated product were removed by Sevag reagent，hydrogen peroxide decolor， the hydrolysate of polysaccharide was dialyzed by the reverse flow to get the fine product. Finally， the chemical compositions of the fine product after derivatization were examined by the gas chromatography-mass spectrometric analysis.ResultsThe polysaccharides are composed of ribose，mannose，glucose and galactose.The major monosaccharide components are ribose， galactose and glucose.ConclusionThe method reported in this paper is simple，and can be used for analysis of monosaccharides hydrolyzed from Liucha polysaccharide.
Key words： Liucha polysaccharide; Purify; Gas chromatography-mass spectrometry; Monosaccharide
柳茶为藏族民间常用药，以蔷薇科(Rosaceae)鲜卑花属(Sibiraea)植物窄叶鲜卑花Sibiraea angustata (Rehd.) Hand-Mazz. 和鲜卑花Sibiraea laecigata (L) Maxim.的枝叶及果序(带果实的果枝)入药，主要用于消食导滞、疏散风热;据藏药文献记载，柳茶主治热病和疫病[1]。现藏族民间常作茶饮，治疗食后腹胀等诸多原因引起的消化不良，每每见效。柳茶中除含有挥发油、微量元素外，通过实验发现还含有丰富的多糖。多糖作为提高机体免疫功能的保健品已被许多人接受，但许多多糖产品仅仅停留在保健品阶段，未能开发成药物，主要原因是多糖的分离纯化困难，技术不过关。因此本文旨在对柳茶多糖的提取、纯化、组分分析进行研究并对其营养保健功能进行探讨，以期为柳茶的开发及其综合利用提供参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器 UV-2450紫外分光光度计(日本岛津) ; NE2155电子天平(德国赛多利斯仪器公司);Agilent 5793I-6890气相色谱-质谱联用仪(GC-MS);SE-54弹性石英毛细管柱(50 m×0.25 mm id×0.50 μm);高纯氦(纯度≥99.999%);旋转蒸发仪(上海青浦泸西仪器厂)。
1.2 材料 鲜卑花属植物叶采自甘肃省甘南藏族自治州合作市郊，海拔3 200 m以上。经兰州大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定其为蔷薇科(Rosaceae)鲜卑花属(Sibiraea)植物窄叶鲜卑花Sibiraea angustata (Rehd.) Hand-Mazz. 和鲜卑花Sibiraea laecigata (L) Maxim.的叶。
单糖标准品葡糖糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖标准品 (Fluka公司)，盐酸羟胺、吡啶、三氟乙酸、乙酸酐、氯仿以及其他试剂等均为国产分析纯，蒸馏水为实验室自制。
2 方法
2.1 多糖的提取与纯化
2.1.1 粗多糖的提取取一定量的柳茶依次用石油醚、乙醚除去脂溶性杂质。加10倍量的水90～100℃提取3次，3 h/次，合并水提液，过滤。70℃水浴减压浓缩至适量，加入5倍量95 %的乙醇纯析，静置过夜，离心过滤，置真空冷冻干燥得柳茶多糖粗品。
2.1.2 粗多糖纯化[2]将多糖粗品溶于蒸馏水，去不溶物，按Sevag法(氯仿∶正丁醇=4∶1)脱蛋白，重复10次以上，然后移至透析袋中用去离子水逆流透析24 h，直至紫外光谱分析检测无蛋白吸收。以氨水调节pH为8，滴加H2O2，50℃保温脱色2 h，减压浓缩，加入5倍量的无水乙醇，静置过夜，离心收集沉淀，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚漂洗2次，冷冻干燥得去蛋白多糖纯品。
2.1.3 紫外光谱分析 取柳茶多糖适量，加水溶解，配制成浓度为1.0 g/L的多糖水溶液，采用紫外可见分光光度法190～700 nm范围内扫描。光谱显示柳茶多糖具有多糖特征性的紫外吸收图谱仅在200 nm处有一锐细吸收峰，大于250 nm无明显的紫外吸收，是平坦的背景。结果表明，提取纯化的多糖中不含有核酸、蛋白质以及其他杂质成分。
2.2 柳茶多糖的气相色谱质谱测定
2.2.1 供试品溶液(糖腈乙酰酯衍生物)的制备称取20 mg柳茶纯化多糖样品溶于2 ml 2 mo1/L的TFA中，封管，于100℃水解6 h，减压除尽TFA。在水解产物中加入20 mg盐酸羟胺和1 ml吡啶，封管于90℃反应30 min。冷至室温，再加入1 ml乙酸酐，封管于90℃反应30 min，冷却后转出上层清液，减压浓缩至干。滴入0.5 ml氯仿溶解后进行气相色谱——质谱分析。
2.2.2 对照品溶液的制备精密称取单糖标准品葡糖糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖对照品20 mg，采用上述方法制备乙酰化衍生物，氯仿溶解后进行气相色谱—质谱分析。
2.3 GC-MS分析条件
2.3.1 色谱条件SE-54毛细管柱，气化室温度270℃，柱前压17.8 kPa，分流比30∶1，采用恒流模式载气He流量1.2 ml/min，进样量1 μl，程序升温：起始温度100℃保持6 min，以20℃/ min 升至220℃保持14 min，以5℃/ min 升至290℃。
2.3.2 质谱条件电子轰击源(EI)，电子能量70 eV ;离子源温度：230℃;四极杆温度：150℃;传输杆温度：280℃;扫描范围：14～400 amu。
3 结果
3.1 单糖标准品和柳茶多糖的GC—MS分析
3.1.1 混合单糖标准品乙酰化衍生物的总离子流图见图1。根据单糖标准品的乙酰化衍生物的GC-MS的总离子流图，确定7种混合单糖标准品的GC一MS总离子流图的出峰顺序为果糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。
3.1.2 柳茶多糖的乙酰化衍生物的总离子流图见图2。根据柳茶多糖的总离子流图，通过各峰的保留时间和标准质谱尼斯特谱库(NIST)对照分析可以确定其含有核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，出峰时间及其组成含量见表1。
4 讨论
分析多糖中单糖组成，首要的工作就是将多糖样品进行彻底的水解。因为如果水解效果不理想，多糖很难完全水解为单糖或者仅仅有很少部分水解，导致样品水解衍生化产物在气相色谱分析中峰值很小，从而影响多糖中含量较少的单糖测定。通过对影响水解效果的各种因素的综合考察分析，得出对于柳茶多糖的水解应采用2 ml 2mo1/L的TFA水解6 h较为合适。在此水解条件下，可以使多糖较为完全地水解。而硫酸也可用于多糖的水解，但实验时采用低浓度的硫酸水解时效果不理想，高浓度的硫酸则易造成多糖的碳化。且由于硫酸沸点比较高，水解后残留的酸不容易挥发除去，必须用碳酸钡中和处理，容易造成样品组分的损失。
表1 柳茶多糖中的单糖含量
柳茶多糖在空气中提取或干燥时颜色会加深，可用过氧化氢或活性炭脱色，活性炭在脱色时使用量大，样品损失较多，故采用H2O2脱色。在用过氧化氢脱色处理后，一定要透析至无过氧化氢检出，H2O2检出用高锰酸钾法。此外，在醇洗及醚洗、抽滤时用薄膜盖住样品，可减少空气接触，防止颜色加深。在脱色时50℃保温脱色2 h，时间短色素太多影响检测结果，时间长也没有更好的脱色效果。
柳茶中除含有挥发油、微量元素、三萜类化合物等多种化学成分外，课题组发现其所含多糖也是其主要活性成分之一;多糖作为药物应用是在20世纪40年代，自20世纪60年代以来，人们陆续发现多糖具有更多的生物活性。不仅具有免疫调节功能，还可以抗感染、降血糖和抗肿瘤等，随着多糖类化合物研究的深入，其在抗肿瘤和病毒的临床治疗方面显示了广阔的应用前景。本文首次对柳茶多糖的化学组成进行研究，对开发利用本地资源有一定的意义。对其化学结构的进一步研究，将有利于阐明其活性与成分的关系。
【参考文献】
[1] 甘肃省卫生局.甘肃中草药手册，第3册[M].兰州：甘肃人民出版社，1973：1554.
[2] 方积年,丁 侃.天然药物-多糖的主要生物活性及分离纯化方法[J].中国天然药物,2007,95(5):338.