葛根为豆科植物野葛或粉葛的根,在我国除新疆、西藏等地区外均有生长,资源丰富。葛根的淀粉含量高达40% ,是一种营养独特、药食兼优的绿色保健食品,富含人体必需的
13种氨基酸和铁、钙、硒、锌、锗等微量元素;其所含的黄酮类物质,具有防止
高血压及动脉硬化,活血化淤,抗肝脏毒,抗炎,祛痰,解热,提高机体免疫功能,抗菌,抗病毒,缓解高血压
患者的
头痛等多种药理作用[ 1, 2 ]。葛根素注射剂已用于
临床,可使心脏博动速率减慢,心肌收缩加强,使冠状动脉及外周血管扩张,故可抗心胶痛,降血压,降低心肌耗氧量[ 3 ]。关于葛粉的生产方法、葛根黄酮的提取方法、及葛根素的提纯工艺已有大量文献报道[ 4～7 ]。其中李剑君等认为AB28型大孔吸附树脂是一种理想的吸附分离剂;潘娓婕等报道了可用酸水解法从葛根中提取葛根素和大豆苷元,认为葛根素和大豆苷元在酸性条件下难以水解,而葛根中的其它异黄酮苷类化合物则被水解为葛根素和大豆苷元,这样,葛根提取液经酸水解后再利用大孔吸附树脂分离即可得到纯度较高的葛根素。我们在小试的基础上,对葛根资源的综合利用中试工艺进行了一些尝试,即生产葛粉的同时,从“废液”、“废渣”中获得葛根黄酮及葛根素,供开发者参考。
1 实验部分
1. 1 仪器、设备及原料 LC210AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司) , UV21601 型紫外可见分光光度计(日本岛津公司) ;电子天平(北京赛多利天平有限公司) , 100 L多功能提取罐(湖南衡阳制药机械厂) , 50 L搅拌反应釜(湖南衡阳制药机械厂) ,磨浆机(自制,改装) , 沉淀槽(自制) , 层析柱( ф200 mm ×1000 mm,自制) ,葛根素对照品(中国药品生物制品检定所,批号: 1107522200209) ,鲜葛根(产自安徽霍山大别山区,采于12月下旬,自收购) ,大孔吸附树脂(AB28型,南开大学化工厂) , 95%食用酒精,盐酸、氢氧化钠等为市售化工原料。
1. 2 葛粉的制备 将100 kg鲜葛根用刀削去藤蒂、尾须、侧根和破损部分,放入清水中浸泡1. 5 h,并洗尽泥沙杂物后捞起,用刀子刮除外皮,再放入清水中冲洗干净,捞起沥干明水。切成10 cm左右的根段,放入磨浆机中打浆,边打边加水,控制水量为鲜葛根重量的10倍量,然后在粉浆内加入2倍量清水稀释,搅拌均匀,分别用80目和100目钢丝网筛过滤去筋渣。滤浆迅速放进沉淀槽内,加入微量明矾溶液,用干净的钢管插入粉浆中顺时针方向搅动,使杂质沉于底部,让其自然沉淀,收集上层清液待用,收集上层黄粉待用,再加入适量水搅拌均匀,静置沉淀12 h,收集上层清液待用,在湿葛粉上覆盖3层白布,吸干剩余水分。揭去白布,用铲刀分离上层黄粉(待用) ,将沉淀槽中湿粉取出,底层渣沫收集待用,湿粉置烘箱中50～60℃烘干,得银白色的纯天然葛粉1814 kg,葛粉得率18. 4%。
1. 3 葛根黄酮的制备 将上述黄粉、渣沫、藤蒂、尾须、侧根和破损部分等固体物置于多功能提取罐中以6倍量70%乙醇提取2次,每次1h,提取液过滤,浓缩至无醇味。浓缩液与上述上层清液合并,在一定压力下通过AB28大孔吸附树脂层析柱动态吸附,吸附完全后用清水冲洗至无色,再用80%乙醇进行洗脱,洗脱液于多功能提取罐中蒸干乙醇,共得葛根粗黄酮417 g。粗黄酮用95%乙醇溶解,过滤,重复2次,合并乙醇溶液,浓缩成浸膏,于真空干燥箱中烘干,得精制黄酮205 g。
1. 4 葛根素的纯化和精制 参考文献[ 7 ]方法,取100g葛根黄酮粗品浸膏,加5%盐酸加热回流水解5 h, ,趁热过滤,浓缩滤液至少量,放置过夜,析出葛根素粗品7. 6 g。将此粗品上大孔树脂层析柱,以30% , 50% , 80%乙醇梯度洗脱, TLC跟踪(展开剂:体积比CHCl3 ∶CH3OH∶H2O = 4∶1∶0. 05) ,收集的洗脱液浓缩至干,得白色粉末。再用体积比为1∶1的甲醇2醋酸混合溶剂重结晶,得到无色针状葛根素结晶4. 8 g。
1. 5 葛根素的含量测定[ 8 ] 葛根素含量是葛根黄酮的一个重要质量指标,我们以HPLC法测定葛根素含量,以保留时间进行定性,以外标法进行定量。测试条件为Hyper ODS C18柱,流量为1 ml·min- 1 ,流动相为甲醇∶水= 25∶75,检测器为UV 254 nm,柱温为40℃。
1. 5. 1 标准曲线的绘制 精密称取葛根素对照品7. 43 mg,加甲醇25 ml;精密吸取2 ml于10 ml量瓶中,加甲醇定容至刻度。分别精密吸取此稀释液2、4、8、12、20、25 μl注入
HPLC,将峰面积与进样量进行线性回归,计算得回归方程为:Y = 1378994. 891X - 25095. 97566 ( r = 0. 999 8 ) 。葛根素为0.11888～1. 4860μg时线性关系良好;平均回收率98. 36%( n = 5) , RSD = 1. 28% ( n = 5) 。
1. 5. 2 样品的测定 精密吸取各试验项下的供试液1 ml,用流动相稀释至10 ml,用0. 45μm微孔滤膜过滤,取滤液10μl进样,测定峰面积,根据回归方程计算葛根素含量。
2 结果与讨论
2. 1 葛根资源综合利用工艺流程 根据生产实际画出工艺流程框图。实际生产时,可利用地势差,把层析柱安装在沉淀槽的下方,以使“废液”流过层析柱时,具有一定的位压,这样可以提高生产效率和节约加压成本。根据文献[ 9 ] ,AB28大孔树脂对葛根素的饱和吸附量是32. 49 mg·g- 1 ,对葛根总黄铜的饱和吸附量是72. 72 mg·g- 1 ,约相当于每公斤AB28大孔树脂可以处理290 kg鲜葛根产生的3. 8吨“废水”。我们在实验时也用过大孔树脂静态吸附法,但此方法与动态吸附法在吸附量和解析难易程度上无显著区别,且静态吸附操作麻烦,不易实现连续化生产。
2. 2 葛根素含量测定 葛根素含量测定按“1. 5”进行。精制黄酮中葛根素含量为40. 6% ( n = 3) ,精制葛根素纯度为97.6% ( n = 3) 。
2. 3 葛根资源综合利用的必要性和可行性 葛根资源虽然在我国有大量分布,但近年来采挖量逐年增加,对部分地区水土保持造成了一定危害。部分劳动密集型企业生产技术落后,产品单一,不论野葛还是粉葛都拿来制造葛粉,不仅带来了大量污染,而且葛根主要药用成分都随废水、废渣流失,企业经济效益差,对葛根资源造成了极大浪费。葛根综合利用生产工艺可以最大程度地利用葛根资源,同时生产葛粉,葛根黄酮和葛根素。提高了产品附加值,增加了企业经济效益,减少了环境污染。
本工艺采用大孔树脂吸附法回收葛根黄酮,设备投资小,操作简单,树脂再生容易;多功能提取罐既可以作为提取设备,又可以作为溶剂回收设备,减少了设备投资,降低了能耗;山区小厂可自配10～30 kw水力发电机,水流过水轮机之后再用作冷凝,漂洗和磨浆,这样不仅节约了水资源,而且降低了能耗,解决了山区电力不足的困难。
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