复方田七益智颗粒提取工艺及质量标准研究

【摘要】 目的 优选复方田七益智颗粒的最佳提取工艺,并建立其质量标准。方法 以总皂苷的得率为指标,运用正交试验优选复方田七益智颗粒最佳提取工艺。用TLC法对制剂中三七、人参进行定性鉴别,用分光光度法测定制剂中总皂苷含量。结果 最佳提取工艺为：微波提取3次,加水量为10倍,每次30 min。TLC法供试品与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点,阴性无干扰。人参皂苷Re在40～200 μg范围内线性关系良好,Y＝250.83X－0.017, r＝0.997 2,精密度和回收率符合要求。结论 本试验确定的提取工艺及质量标准在实际生产中可行。

【关键词】  复方田七益智颗粒；正交试验；提取工艺；质量标准；薄层色谱；高效液相色谱法

Extraction Techniques and Quality Standards of Compound Tianqi Yizhi Granule 
　　
　　DENG Jia-gang, DU Zheng-cai

　　Guangxi College of TCM, Nanning 530001, China

    Abstract：Objective To investigate the best conditions of extraction techniques for compound Tianqi Yizhi granule and to establish its quality standards. Methods The best conditions of extraction techniques for compound Tianqi Yizhi granule were optimized by orthogonal experiments, with the yield of total saponins as the index. The qualitative analysis of Panax Notoginseng and Ginseng with Thin-Layer Chromatography and determination of total saponins with UV-spectrophotometry was made. Results The optimal condition of total saponins was that the microwave extraction for 3 times and extracting for 30 minutes, the material-water rate of 1∶10. In TLC procedure, the control material and the test sample showed the same colored spots, while the negative control sample showed no interference. Ginsenoside Re showed a good linear relationship at the range of 40～200 μg, Y＝250.83X－0.017, r＝0.997 2. The accuracy and precision were accord to the standards. Conclusion The extraction techniques and the quality standards are feasible.

　　Key words：compound Tianqi Yizhi granule；orthogonal experiment；extraction techniques；quality standards；TLC；HPLC
 
    复方田七益智颗粒是我们在总结前贤治疗血管性痴呆的基础上,结合多年临床经验与现代药理研究成果而创制的。为使该方形成疗效可靠的颗粒制剂,我们采用L9(34)正交设计安排实验,以该方主要功效成分总皂苷的含量为考察指标,对其提取工艺进行研究,以期优选出可行的提取方法,并建立有效的质量控制标准。

　　1  仪器与试药

    UV Agilent 8453紫外分光光度仪(安捷伦中国有限公司)；EL204十万分之一克电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；玻璃层析柱(8 mm×90 mm)；D101型大孔吸附树脂(天津骨胶厂,40～60目)；TLC常规预制板(10 cm×10 cm,江苏汉邦科技有限公司)。

    人参皂苷Rb1(批号071002)、人参皂苷Re(批号070901)、人参皂苷Rg1(批号071002)、三七皂苷R1(070501)对照品均购于中国药品生物制品检定所；药材(市售并经广西中医学院生药学教研室韦松基教授鉴定均为正品)；甲醇、乙醇、高氯酸、香草醛、冰醋酸等试剂均为分析纯。

　　2  方法

　　2.1  提取方法

    处方中(三七、人参)总皂苷可溶于水和乙醇,设计了以下3种提取方法。

　　2.1.1  水煎醇沉法
 　　
　　按处方配比三七、人参共27 g,将三七、人参粉碎成粗粉(20～40目),混合加水煎煮,具体按正交试验安排进行。将煎好的药液合并、浓缩,加2倍体积95%乙醇沉淀过夜,减压回收乙醇,浓缩定容至100 mL备用。

　　2.1.2  微波辅助水煎醇沉法 

　　除加热工具为家用微波炉40%火力外,其他具体方法同上。

　　2.1.3  60%乙醇回流法 

　　按处方配比取三七、人参共27 g,将三七、人参粉碎成粗粉(20～40目),混合加60%乙醇水浴加热回流,具体按正交试验安排进行。将煎好的药液合并、过滤、减压回收乙醇,浓缩定容至100 mL备用。

　　2.2  总皂苷含量测定方法

　　2.2.1  吸附树脂的制作 

　　将大孔树脂用95%乙醇浸泡2 d,加热回流12 h,抽滤,用水漂洗除去杂质,洗至滤液与水(1∶2)混合不产生混浊,水浸泡备用。用滴管吸取浸泡膨胀的树脂,加入盛水的层析柱内,打开活塞,保持水向下流动,至装入树脂达6 cm高,覆以脱脂棉少许,压紧,用蒸馏水冲洗后备用[1]。

　　2.2.2  对照品溶液的制备 

　　精密称取120 ℃干燥至恒重的人参皂苷Re标准品20.0 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL,即每1 mL含人参皂苷Re 2.0 mg。

　　2.2.3  样品柱层析 

　　精密量取1 mL供试品溶液,倾入D101大孔吸附树脂柱中(带活塞的8 mm×90 mm柱内装D101大孔吸附树脂约5 g),加热水30 mL,以1 mL/min的流速过柱,用70%冷乙醇25 mL以0.5 mL/min流速淋洗色层柱,弃去开头2 mL流出液,然后收集洗脱液,置60 ℃水浴上蒸干,用甲醇溶解残渣,定容至5.0 mL供检。

　　2.2.4  标准曲线的制备 

　　分别吸取人参皂苷Re标准溶液(2.0 mg/mL) 0、20、40、60、80、100 μL(相当于人参皂苷Re 0、40、80、120、160、200 μg)于10 mL比色管中,用氮气吹干,准确加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液,再加0.8 mL高氯酸,塞紧盖子,于60 ℃以下水浴上加温15 min取出,冷却后准确加入冰乙酸5.0 mL,摇匀后以1.0 cm比色皿、560 nm处测定吸光度,绘制标准曲线,回归方程为：Y＝250.83X－0.017,r＝0.997 2。

　　2.2.5  供试品含量测定 

　　精密量取“2.2.3”项下各提取液100 μL,置10 mL具塞试管中,于水浴中挥干溶剂,照标准曲线制备项下方法“自加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL”起,依法测定吸光度,代入回归方程计算,即得提取液中总皂苷含量。

　　2.3  正交试验设计

    在对溶媒和提取方法初步选择后,提取方法(A)、溶剂用量(B)、提取次数(C)作为考察的3个因素,每个因素各取3个水平，采用L9(34)正交表进行试验(见表1),以提取总皂苷的得率为考察指标。提取时间因提取方法不同有所差异[2-3]。水煎煮：90 min/次；微波水提：30 min/次；乙醇回流提取：90 min/次。表1  正交试验因素水平表(略)

　　3  正交试验结果

　　3.1  结果分析

　　(见表2)表2  正交试验结果分析表(略)

    表2极差结果说明,各因素对提取效果的影响程度依次为A＞C＞B。其中影响最大的是提取方法A,其次为提取次数C,溶剂用量B影响很小。因此,各因素的最佳水平组合为A2C3B2。对数据进行方差分析,结果见表3。可知提取方法与提取次数对指标有显著影响,而溶剂用量对指标无显著影响,与直观分析结果一致,最佳提取方案为：A2C3B2,即微波提取3次,水用量为10倍量。

　　3.2  验证试验

    在以上试验基础上,放大投药量50倍,即1 350 g,按照相同方法重复试验3次,与上述结果相平行,说明优选结果可信。表3  方差分析表(略)   

　　4  质量标准

　　4.1  供试品的制备

    按制剂处方称取药材,混合后加10倍量水,微波加热提取3次,每次0.5 h(第1次浸泡1 h),浓缩煎液至适量,加2倍体积95%乙醇沉淀过夜,过滤,浓缩至相对密度约为1.2～1.3备用,加糊精、甜味剂适量,混合湿法(14目)钢筛制粒,干燥、整粒、灭菌、封装、帖签、入库,即得供试品。连续生产3个批次(批号20080506、20080509、20080512)。

　　4.2  定性鉴别

    取本品3 g,加氯仿30 mL,加热回流1 h,弃去氯仿液,药渣挥干溶剂,加水0.5 mL使湿润,加水饱和的正丁醇20 mL,超声处理30 min,吸取上清液加3倍量氨试液,摇匀,放置分层,取上清液蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液。另取人参对照药材各1.0 g、三七对照药材0.5 g,同法制成对照药材溶液。再取人参皂苷Rgl、Re、Rbl及三七皂苷R1对照品,分别加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述7种溶液各2～4 μL,分别点于同一硅胶G薄层预制板上,以正丁醇-醋酸乙酯-水(4∶2∶5)放置后的上层溶液为展开剂,预平衡30 min,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性无干扰[4]。

　　4.3  含量测定

　　4.3.1  样品供试液的制备 

　　取3个批号复方田七益智颗粒各3.0 g,于60 ℃干燥5 h,精密称定,置100 mL烧杯中,加40 mL 85%乙醇,超声提取(40 kHz,500 W)30 min,再定容至50 mL,摇匀,放置,吸取上清液1.0 mL,挥干后以水溶解残渣,进行柱分离。

　　4.3.2  对照品溶液的制备、样品柱层析、标准曲线的绘制 

　　同“2.2”项下方法。

　　4.3.3  稳定性试验 

　　取样品供试液,按照样品含量测定方法,每隔0.5 h测定1次,共测定6次,测定结果基本一致,RSD＝1.37%。

　　4.3.4  加样回收率试验 

　　取已知含量的样品5份,分别加入定量的人参皂苷Re对照品,按照样品供试液的制备方法制备回收率试验测定液,依照样品含量测定方法测定,计算结果,平均回收率为98.9%,RSD＝0.84%。见表4。表4  总皂苷加样回收率测定结果(略)

　　4.3.5  样品含量测定 

　　精密量取上述过柱并定容(5 mL)的3种溶液各100 μL,分别置于10 mL具盖的离心管中,照“2.2.4”项下方法操作,按分光光度法测定供试液在560 nm处的吸收度,代入回归方程,计算出供试品总皂苷的含量,结果见表5。表5  样品中总皂苷的含量测定结果(略)

　　5  小结与讨论

    在中药颗粒剂的生产制备过程中,提取工艺对其最终产品有效成分含量影响最大,我们用正交试验优选复方田七益智颗粒的提取工艺。由于本方主药三七、人参中均含总皂苷,其药理作用明显,故以总皂苷为考察指标。
    根据试验结果,最佳提取工艺方案为A2C3B2,即微波提取3次,加水量为10倍,每次30 min。微波提取总皂苷得率明显高于其他两种方法,因微波提取是从物料内部加热,有效成分不易被破坏,提取充分,得率高,且与普通生产提取时间一般为90 min相比,大大缩短了提取时间,节约了能源。
   
　　复方田七益智颗粒中三七、人参为主要药材且价格贵,故采用TLC方法定性鉴别。其主要有效成分为总皂苷,故以总皂苷含量为指标,用分光光度法测定该制剂中总皂苷的含量,结果表明,3批样品中总皂苷含量平均为2.56%,平均回收率为98%。在三七、人参的TLC鉴别实验中,以正丁醇-醋酸乙酯-水(4∶2∶5)放置后的上层溶液为展开剂,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰,样品、对照药材色谱斑点清晰可鉴,分离效果很好。

【参考文献】
  　　[1] 黄雨三.保健食品检验与评价技术规范实施手册[M].北京：中科多媒体电子出版社,2003.1241－1242.

　　[2] 徐莲英.中药制药工艺技术解析[M].北京：人民卫生出版社,2003.95－99.

　　[3] 安 晏,陆兔林,马新飞,等.安脉颗粒提取工艺的正交优选[J].中国中医药信息杂志,2008,15(7)：53－56.

　　[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.7－11.