银杏叶片剂中银杏黄酮的HPLC指纹图谱研究中药指纹图谱 | 39康复网

摘要:目的建立评价银杏叶片剂质量优劣的指纹图谱分析方法。方法采用高效液相色谱法，Hypersil ODS (4.6mm×250mm,5um)色谱分析柱，检测波长为360nm，乙晴、异丙醇和0.49%构株酸为流动相，1m L/min的流速梯度洗脱对银杏叶片剂中银杏黄酮进行指纹图谱测定。并采用原国家药品监督管理局推荐的中药指纹图谱计算软件进行计算，建立银杏叶片剂中银杏黄酮的共有指纹图谱。结果HPLC研究银杏叶片剂中银杏黄酮指纹图谱的方法有较好的重现性、精密度和稳定性(RSD均小于3%)。结论本研究将有助于加强银杏叶片剂的质量控制。
关键词:高效液相色谱法;指纹图谱;银杏叶片剂;银杏黄酮
    银杏 ( GinkgobilobaL.)为我国特有的珍稀植物。银杏叶提取物(GBE)中的主要生物活性成分为银杏黄酮糖昔和银杏菇内醋，能有效地防治心脑血管疾病，拮抗血小板活化因子(PAF)，对与自由基有关的疾病如老年性痴呆症、衰老等都有明显的改善作用川，为加强中药生产的质量管理和临床用药的安全，原国家药品监督管理局在中药质量标准中引人指纹图谱技术要求。色谱技术测定指纹图谱具有综合、宏观、“模糊”的非线性特点。近年来，高效液相色谱(HPLC) 、核磁共振(NMR)等在银杳叶注射剂、银杏黄酮的指纹图谱研究方面做了不少工作。
本研究建立了HPLC对银杏叶片剂进行指纹图谱的测定方法，建立银杏叶片剂银杏黄酮的共有指纹图谱。为银杏叶片剂质量控制提供科学依据。
    1 仪器与试药
    HP 1100 高效液相色谱仪及chernstation色谱工作站;乙睛和异丙醇(色谱纯，TEDIA COMPANY,INC);构椽酸为分析纯;水为新鲜乐百氏纯净水;芦丁对照品(美国Sigma-Aldrich公司，;银杏叶片剂生产厂家见表1
    2 实验方法
    2.1 色谱条件
    色谱柱 : HypersilO DS柱(4.6m m× 2 50mm,5um)柱号:7991618-584;流动相:梯度洗脱，0 min:乙睛一异丙醇一0.49%拘椽酸(12.5 0.5:87),50 min:乙睛一异丙醇-0.49%构椽酸(311.68);流速:1 ML/min;检测波长:360nm;柱温:25℃;进样量:10uL.
    2.2 对照品溶液的制备
    精密称取经减压干燥过夜的芦丁对照品0.76mg，用甲醇溶解定容在10 ML量瓶中，制成芦丁对照品溶液，备用。
    2.3 供试品溶液的制备
    采用均匀取样法从每大盒(每大盒10小盒，每小盒24片)银杏叶片剂中取出15片银杳叶片，去除包衣后，研成粉末，精密称取500mg，用甲醇超声溶解，过滤，滤液蒸干，残渣用甲醇定容在25 mL的量瓶中，0.45um滤膜过滤，备用。
    2.4 精密度试验
    取No .9 供试品溶液，在所建立的测定条件下，连续进样5次，第1次进样24 h后第6次进样，分别测定银杏黄酮的日内和日间精密度，采用中药色谱指纹图谱的相似性计算软件(中南大学设计)计算，6次进样的色谱图其相似度均为0.9以上，同时以芦丁峰面积为观测指标，其峰面积的日内和日间RSD分别为0.09%和0.11%，表明仪器精密度良好。
    2.5 重现性试验
    取No .9 供试品5份，精密称定后，按“2.3"项下制备，按“2.1”项下条件检测，采用中药色谱指纹图谱的相似性计算软件对5次测定结果进行计算，其相似度均为0.9以上，同时以芦丁峰面积为观测指标，其峰面积的RSD值为0.07%，结果表明方法的重现性良好。
    2.6 稳定性实验
    取No .10供试品溶液，分别在0,1,2,4,8,12,24h按所建立的测定条件进行检测，采用中药色谱指纹图谱的相似性计算软件对所得结果进行计算，其相似度均为0.9以上，同时以芦丁峰面积为观测指标，其峰面积的RSD值为0.13%，结果表明在24 h内，银杏叶片剂的色谱指纹图谱基本稳定，没有明显的变化，符合指纹图谱的要求。
    3 结果与讨论
    3.1 指纹图谱的建立及分析
    按所建立的测定条件对10个不同来源的银杳叶片剂中的银杏黄酮进行测定，其典型的HPLC的色谱指纹图谱见图1。有22个主要的共有特征峰(占总峰面积90%以上)，选择6号峰(芦丁)为参照峰，此峰为所有样品所共有的，然后分别求出各特征峰的调整保留时间之比(a值)和相对峰面积(峰面积之比).从表2可知a值为1.00时的组分(6号峰)，是芦丁(通过芦丁对照品的保留时间确定)，其峰面积占总峰面积大于10%，其余单峰面积占总峰面积均小于10%.
    3.2 银杏叶片剂HPLC指纹图谱相似度分析
    指纹图谱的评价指标是供试品指纹图谱与该品种对照用指纹图谱(共有模式)及供试品之间指纹图谱的相似性。采用国家食品药品监督管理局推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度计算软件”(中南大学设计)对测定结果进行计算，得到银杏叶片剂HPLC共有指纹图谱见图2。对照共有指纹图谱，10个银杏叶片剂的相似性分析结果见表3.从此结果可以看出，10个不同来源的银杳叶片样本图谱的相似度均在90%以上，未发现离群样本，表明以上各厂家采用标准提取物生产的银杏叶片基本符合要求。
    4 讨论
    4.1 流动相的确定:色谱指纹图谱试验条件应能满足指纹图谱的需要，不宜简单套用含量测定用的试验条件，为获取足以代表银杳叶片特征的指纹图谱，试验过程中，对多种流动相如①甲醇一0.1%磷酸，②甲醇一四氢吠喃一0.1%磷酸，③甲醇一异丙醇一四氢吠喃一0.1%磷酸，④乙睛一异丙醇-0.49%拘椽酸等进行了选择，经比较发现在④色谱条件中的流动相条件下，色谱图上各个色谱峰的分离度良好，保留时间适中，因此选此流动相系统作为银杏黄酮HPLC指纹图谱检测的流动相。
    4.2 本实验选择了262,280,318,340,360 nm5个波长同时进行测定，而且采用二极管阵列检测器的全波长扫描功能对银杏黄酮的最大吸收波长进行选择，结果在波长360nm下出现的色谱峰最多，芦丁峰吸收最强，且基线平稳，故选择360nm作为银杏黄酮HPLC指纹图谱的检测波长。
    4.3 所建立的银杏叶片剂HPLC指纹图谱中，有22个共有特征(指纹)峰，各特征峰的调整保留时间之比(a值)和相对峰面积(峰面积之比)可以作为银杏叶片剂质量伪劣的依据，同时借助国家食品药品监督管理局推荐的中药色谱指纹图谱的相似性计算软件(中南大学设计)建立的银杏叶片剂中银杏黄酮HPLC共有指纹图谱，可作为银杏叶片剂中银杏黄酮部分的质量控制依据。所建立的方法有较好的重现性、精密度和稳定性，为银杏叶片剂的质量控制以及衡量其质量的优劣提供部分科学依据。

作者： 2006-3-27