黄芩中4种黄酮的HPLC定量分析及其黄酮类成分指纹图谱研究中药指纹图谱 | 39康复网

摘要：目的：建立同时测定黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量的HLC方法以及黄芩中黄酮类成分的指纹图谱。方法：Platinum C18色谱柱（4.6mm×250mm,5um），CH3CN与H2O-THF-H3PO4（8010:0.2）溶剂系统梯度洗脱，检测波长274 nm，流速1ml/min，进样量10ul。结果：黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素线性范围分别为0.40～2.0ug（r=0.9999），0.097～0.49ug（r=0.9999），0.024～0.12ug（r=0.9997），0.021～0.061ug（r=0.9996）；平均回收率（n=5）分别为101.5%（RSD=2.2%），99.5%（RSD=2.3%），98.9%（RSD=1.0%），100.4%（RSD=3.0%）。确定了黄芩中黄酮类成分指纹图谱中的14个共有峰。结论：本方法重现性好，专属性强，将为黄芩药材质量控制提供科学依据。
关键词:黄芩黄酮 HPLC 指纹图谱
    黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis的干燥根，为常用中药，具有清热泄火、解毒、止血、安胎等作用，其中黄酮类化合物为主要有效成分。目前从黄芩中提取并鉴定出结构的黄酮类成分已有十几种，含量较高的成分有黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素。因此，研究制定此4种成分含量的药材标准，对提高黄芩的整体质量水平有很大的意义。目前中国药典2000年版一部中，仅对黄芩中的黄芩苷进行含量测定。而文献报道有关黄芩及其制剂中黄芩苷的含量测定方法较多，如薄层层析-比色法、HPLC法、离子对色谱法、二级导数光谱法等。由于黄芩苷和汉黄芩苷与其苷元在极性和含量上的差别，用固定比例流动相同时测定4种成分难度较大。
    本文利用RP-HPLC梯度洗脱法，建立了同时测定黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量的方法，并对10个不同地区的黄芩进行了分析。在此基础上，还建立了黄芩中黄酮类成分的指纹图谱，通过对10批样品指纹图谱的分析，确定了指纹图谱的14个共有峰。结果表明批与批之间各共有峰的相对保留时间重现性较好，而相对峰面积的可比性较差。该含量测定方法和指纹图谱的建立，将为黄芩药材质量控制提供依据。
1 仪器和试药
    Waters高效液相色谱仪：包括LC-2690泵，996二极管阵列检测器，600自动进样器，Millenium32数据处理软件系统。
    乙腈为色谱纯；水为Milli-Q；四氢呋喃（THF）、磷酸、甲醇和70%乙醇为分析纯。
    10批黄芩样品来源见表2,。经中国药品生物制品检定所中药室肖新月副研究员鉴定均为正品黄芩Scutellaria baicalensis。
    黄芩苷对照品由中国药品生物制品检定所提供，含量大于98%；汉黄芩苷对照品为自制，通过解析其NMR和FAB-MS光谱数据，并与汉黄芩素的NMR数据相比较，确定其结构为汉黄芩苷，HPLC归一化法计算其含量大于99%；黄芩素对照品由日本米山药品工业株式会社提供，HPLC归一化法计算其含量为96%；汉黄芩素对照品为自制，通过解析其NMR和MS光谱数据，并参考文献，确定其结构为汉黄芩素，HPLC归一化法计算其含量大于98%。
2 色谱条件
    色谱柱：Platinum（Alltech）C18（4.6mm×250mm,5um）；流动相：CH3CN与H2O-THF-H3PO4（8010:0.2），梯度洗脱；检测波长：274nm；流速：1ml/min；进样量：10ul。含量测定和指纹图谱的梯度洗脱时间程序见表1。
3实验溶液制备
3.1 供试品溶液取黄芩细粉（过3号筛）)0.2g，精密称定，置100ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀。超声30min，室温放置30min，过滤。取续滤液2ml置5ml量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，以0.45um滤膜滤过，即得。
3.2 对照品溶液取黄芩苷（0.250mg/ml）、汉黄芩苷（0.0868mg/ml）、黄芩素（0.106mg/ml）和汉黄芩素（0.148mg/ml）0.5ml置同一,25ml量瓶内，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得.
4方法学考察
4.1 线性关系取; 个不同浓度的对照品溶液分别进样10ul，按上述色谱条件测定峰面积，结果以进样量为横坐标（X），以峰面积值为纵坐标（Y）进行线性回归，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的回归方程分别为：
Y=3202474X+79479 r=0.9999
Y=3607X+9835 r=0.9999.
Y=4321X-10882 r=0.9997
Y=6584X-36884 r=0.9996
    线性范围分别为：0.40～2.0,0.097～0.49，0.024～0.12，0.021～)0.061ug。
4.2 精密度试验精密
    吸取对照品溶液10ul，连续进样6次，测得峰面积，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素4种成分的RSD分别为0.74%，1.1%，1.1%，1.6%。
4.3 重复性试验
    取同一批样品6份，按“3.1”项制备供试品溶液，按上述色谱条件测定含量，结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素平均含量（ n=6）分别为11.34%，2.92%1,0.80%，0.26%；RD分别为1.0%，1.5%，2.6%，3.1%。
4.4加样回收率试验
    取已测知含量的样品0.15G，精密称定，精密加入各种对照品溶液如下：黄芩苷（0.807 mg/ml）4mL；汉黄芩苷（0.488 mg/ml）2ml；黄芩素（0.141mg/ml）3ml；汉黄芩素（0.155mg/ml）1ml，照“3.1”项操作，测定5次，结果黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的平均回收率（n=5）分别为101.5%，99.5%，98.9%，100.4%；RSD分别为2.2%，2.3%，1.0%，3.0%。
5 样品测定
    照本文方法，对10批黄芩样品进行含量测定，每批平行测定2份.
6 指纹图谱的建立
    照“3.1”项下方法制备供试品溶液，用“2”项下指纹图谱梯度程序对10批黄芩样品进行指纹图谱分析，找出共有峰14个。以黄芩苷的保留时间为基准（相对保留时间为1），计算各共有峰的相对保留时间见表3。指纹图谱见图2。
7 讨论
    中国药典2000年版规定黄芩中黄芩苷含量不得低于9%。本试验所测定10批黄芩样品中，7批样品的黄芩苷含量高于9%，同时这7批样品中汉黄芩苷的含量高于2%，而另外3批样品中黄芩苷含量低于9%且汉黄芩苷的含量低于2%。黄芩素和汉黄芩素的含量没有明显规律。这表明黄芩苷和汉黄芩苷含量的高低与黄芩质量的优劣有直接关系。
    本试验方法同时测定4种成分，为保证4种成分都能提取完全，比较了3种溶剂即70%乙醇、甲醇、甲醇-THF（11）超声提取的提出率。根据实验结果，选用70%乙醇作溶剂。虽然黄芩素和汉黄芩素极性小，在70%乙醇中溶解度较黄芩苷小，但由于黄芩苷的含量是黄芩素的十几倍、汉黄芩素的几十倍，要使黄芩苷提取完全需要大量的溶剂，而在大量的溶剂中，少量的黄芩素和汉黄芩素是可以提取完全的，加样回收率的实验结果证实了这一点。通过比较不同溶剂量（25，50，100，200ml的提出率，结果表明100ml70%乙醇提取率最高。通过比较不同超声时间（15，30，45，60min）的提出率，结果表明超声30min提取率最高。
中国药典以及文献中都是报道HPLC法测定黄芩中黄芩苷含量的色谱条件。曾借鉴这些方法包括MeOH-H2O-HAc，MeOH-H2O-H3PO4，CH3CN-H2O- Hac, CH3CN-H2O- H3PO4溶剂系统分离黄芩中的4种成分，均未得到满意的效果。这是由于黄芩苷和汉黄芩苷与黄芩素和汉黄芩素的极性差别较大，后2种成分的出峰时间很慢，量又少，结果汉黄芩素总是以一个小馒头峰的形式出现。当在流动相中加入THF，可加快黄芩素和汉黄芩素的出峰时间，而对黄芩苷和汉黄芩苷出峰时间的加快速度较慢。经反复摸索，用CH3CN与H2O-THF- H3PO4（8010:0.2）溶剂系统梯度洗脱的色谱条件可得到分离度好、出峰时间适宜的各组分色谱峰。

作者： 2006-3-27