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摘要: 目的:采用RP2HPLC (DAD) 对不同产地毛脉酸模药材进行指纹图谱比较。方法:用P lanetsil C18分析柱, 甲醇-0.1% 磷酸水线性梯度洗脱, 检测波长254 nm , 洗脱时间50m in, 体积流量1.0mL/m in, 柱温35℃, 测定了12 个不同产地的毛脉酸模药材的HPLC 指纹图谱。结果:方法学考察表明, 本研究建立的分析方法有较好的重现性; 不同产地毛脉酸模药材共有峰面积的比值有一定的差异。结论 本方法可用作毛脉酸模药材的具有专属性的指纹图谱的建立。
关键词: 毛脉酸模; 指纹图谱; 高效液相色谱; 梯度洗脱法
毛脉酸模R um ex gm elin i Tu rcz. 为蓼科酸模属多年生宿根草本植物, 广泛分布于黑龙江省大、小兴安岭及张广才岭等地区, 是黑龙江省、吉林长白山地区的重要药用植物资源, 在民间常以根入药, 对淋病、上呼吸道感染、癣病和疮毒有确切疗效[ 1～3 ]。毛脉酸模根中主要含有蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类和酸模素等化合物, 现已从毛脉酸模根中分离得到大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、白藜芦醇、白藜芦醇苷和酸模素等多种成分[ 4～5 ]。按指纹图谱的目的即对原料药材进行质控, 要求对药材应固定品种、固定适宜的药材采收地。故本实验主要对12个野生毛脉酸模样品(采自黑龙江省各林区) 进行指纹图谱的分析和比较, 可区分不同产地毛脉酸模药材质量的异同, 为毛脉酸模的鉴别和药材指纹图谱研究奠定基础。
1 仪器、试剂与试药
1.1 仪器: 美国W aters 高效液相色谱仪(Waters2695 型泵, 2996 型二极管阵列检测器, Empow er 色谱工作站) ; 色谱柱P lanet sil C18分析柱(200 mm×4. 6 mm , 5μm) ;D ikma 微孔滤膜(0.45μm) ; 瑞士M et t ler A E 240 电子天平。
1.2 试剂: 甲醇为色谱纯(美国D ikm a 公司) ; 磷酸为分析纯; 水为重蒸水(自制) , 并经0.45μm水系滤膜滤过。
1.3 对照品: 白藜芦醇苷、白藜芦醇(Sigma 公司) , 大黄素、大黄酚、大黄素甲醚(中国药品生物制品检定所) , 酸模素、大黄酚-O-2B-D -葡萄糖苷从毛脉酸模根中分离得到, 经波谱分析鉴定结构, 归一化法计算其质量分数为98% 以上。
1.4 药材: 12 个产地野生毛脉酸模样品(采自黑龙江省各林区) , 经笔者鉴定为蓼科酸模属植物毛脉酸模R um ex gm elin i Tu rcz. 的干燥根及根茎。将上述药材样品经低温干燥后, 粉碎成粗粉(过80 目筛) , 备用。药材具体来源见表1。
表1 毛脉酸模的来源
Table 1 Source of R. gmelin i
编号样 品采收时间编号样 品采收时间
1 大兴安岭新林2001-09 7 绥棱义气松2002-09
2 大兴安岭加格达奇2001-09 8 尚志市帽儿山2002-09
3 大兴安岭塔河2001-09 9 伊春市翠峦2003-09
4 桃山跃进2002-09 10 伊春市红星区2003-09
5 桃山神树2002-09 11 伊春市上甘岭2003-09
6 绥棱北股流2002-09 12 伊春市新青桦林2003-09
2 实验方法
2.1 色谱条件的选择: 分别以甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-磷酸的不同比例及不同梯度进行试验, 记录不同波长(220、254、290、310、330 nm ) 的色谱图。样品2 h 图谱显示, 50 m in 后无特征峰出现。结果表明, 用甲醇-0.1% 磷酸水线性梯度洗脱, 检测波长254 nm , 洗脱时间50 m in, 体积流量1.0 mL/m in, 柱温35℃ 为佳。
2.2 供试品溶液的制备: 称取不同产地毛脉酸模药材样品各0.25 g, 置索氏提取器内加95% 乙醇65mL 提取4 h, 滤过, 蒸干。残渣用25 mL 甲醇溶解并定容至刻度, 此溶液再过0.45μm 的微孔滤膜,弃去初滤液, 取续滤液作为供试品溶液。
2.3 对照品溶液的制备: 分别精密称取白藜芦醇苷、白藜芦醇、酸模素、大黄酚苷、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品适量, 用甲醇溶解制成对照品溶液。
2.4 方法学考察: 为了考察分析方法的可靠性, 以2号(采自大兴安岭加格达奇) 药材为例, 对仪器精密度、方法重现性以及稳定性作了相应考察。
2.4.1 精密度试验: 取同一供试品溶液, 连续进样5 次, 其相对保留时间RSD 小于3% , 主要共有峰面积的RSD 不超过5%。
2.4.2 重现性试验: 取同一产地供试品5 份, 分别按供试品溶液的制备方法制备并测定, 其相对保留时间RSD 小于3% , 主要共有峰面积的RSD 不超过5%。
2.4.3 稳定性试验: 取同一供试品溶液, 分别在0、3、6、9、12 h 检测, 其相对保留时间RSD 小于3% ,主要共有峰面积的RSD 不超过5% , 说明供试品溶液至少在12 h 内稳定。
2.5 指纹图谱的建立
2.5.1 指纹图谱的制备: 分别精密吸取对照品和供试品溶液各20 LL 注入液相色谱仪, 进样, 测定, 记录50 m in 色谱图, 即得。
2.5.2 共有峰的确定: 测定了12 个不同产地毛脉酸模药材样品, 比较其色谱图, 确定共有峰为30个。以10 号峰(18121m in) 为内参比峰, 以其各色谱峰对内参比峰的相对保留时间和相对峰面积定性, 测定各峰相对保留时间RSD < 3% , 共有指纹峰的峰面积之和大于95%。典型色谱图见图1-A。
2.5.3 共有峰的归属: 取对照品溶液各20μL 注入液相色谱仪, 在上述色谱条件下分别进样, 对比各色谱峰的紫外吸收光谱和相对保留时间可知, 指纹谱中5 号峰为白藜芦醇苷(8111 m in) , 7号峰为白藜芦醇(12180 m in) , 15号峰为大黄酚苷(22.56m in ) , 26 号峰为酸模素(29.42 m in) , 28号峰为大黄素(38.91 m in) , 29号峰为大黄酚(41.15 min) ,30号峰为大黄素甲醚(44.43 m in)。
2.6 系统聚类分析: 系统聚类分析是一种无管理、无指导的模式识别方法。依据所测样品的色谱指纹图谱特征, 对样品进行分类。本研究应用SPSS 软件, 采用组间距离法, 以向量余弦相似性作为样品的测度。12 个样品大致分为两类, 第1 类为1、4、8 号样品, 第2 类为其余样品。聚类谱系图见图2。
2.7 相似度分析: 根据聚类分析结果, 以第2 类毛脉酸模(2、3、5、6、7、9、10、11、12 号) 药材的9 批样品的色谱指纹图谱为基础, 建立共有模式。通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(国家药典委员会) , 计算各样品与共有模式间的相似度, 见表2、3,组成共有模式的色谱叠加图见图3。而第1 类1、4、8号样品的色谱图(见图1) , 与共有模式的指纹图谱比较, 各共有峰基本都存在, 但各色谱峰之间的相对峰面积不同, 由此可以看出它们之间的内在质量存在一定的差异。所以, 指纹图谱正是通过这种内在的差异, 达到控制不同批次、不同产地的药材。
3 讨论
3.1 通过对一系列提取方法(超声、索氏、回流提取)、不同的提取溶液和提取时间的考察以及结合有关文献确定了以上供试品溶液的制备方法。
3.2 采用二级管阵列检测器对指纹图谱的检测波长进行了选择, 从190～ 400 nm 内先选出220、254、290、310、330 nm 分离度较好的波长, 分析比较各波长下指纹图谱, 发现检测波长为254 nm 时色谱图所包含的信息量最大, 且各色谱峰分离较好。
3.3 采用HPLC 梯度洗脱法对毛脉酸模药材进行了指纹图谱的研究, 实验证明, 该方法可操作性强、重现性好, 可作为毛脉酸模药材指纹图谱研究的基础。
3.4 按本方法建立的由9 批药材构成的共有模式图和1、4、8 号样品色谱图相比较, 构成共有模式9批样品的相似度较高, 均在90% 以上, 而1、4、8 号样品的相似度均低于90%。从图1 可以看出, 两类毛脉酸模样品差异主要集中在10、15、26、28、29 号峰的峰形及其相对高度上, 构成共有模式样品的色谱指纹图谱中10、15 号峰明显较高, 经研究是蒽醌苷类成分。在第1 类的4 号(桃山跃进)、8 号(尚志市帽儿山) 样品中15、26、28、29 号峰较高, 其中28号峰(大黄素)、29 号峰(大黄酚) 为蒽醌苷元类成分; 在1 号(大兴安岭新林) 样品中26、28、29 号峰的峰位高, 其中26 号峰(酸模素) 的相对高度较其他样品均高, 可能与1 号样品采于水湿洼地有关,故怀疑酸模素的积累可能受水分的影响较大, 具体影响过程有待进一步研究。
3.5 本实验先对所有样品进行聚类分析, 然后选择好的一类样品来建立共有模式, 并将整个色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件, 生成共有模式, 计算相似度。结果表明, 相似度分析结果与系统聚类结果一致, 两种方法得到了相互验证。对于待测样品, 只需测得该样品的色谱指纹图谱, 计算样品相似度, 即可评价其质量。本研究仅收集了12 个产地的毛脉酸模药材, 如能收集更多, 采用分析方法获取更多化学信息, 并以代表临床药效的药理实验进行验证,则对毛脉酸模的质量评价会更加完善和科学。
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作者:王振月, 左月明, 康毅华, 李瑞明, 崔红花