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摘要: 目的:比较江苏道地药材邳州银杏叶在不同采收期的指纹图谱。方法 采用HPLC-DAD 方法。色谱条件为: 色谱柱:A llt ima C18柱(250 mm ×4. 6 mm , 5 Lm) ; 流动相: 乙腈(A ) –0.5% 磷酸水(B) 进行梯度洗脱, 15%～27% A (0～ 40 m in) , 27%～ 15% A (40～ 60 m in) , 15% A (60～ 75 m in) ; 体积流量: 1 mL/m in; 柱温: 20℃; 检测波长: 360 nm。并应用计算机辅助相似性评价系统对银杏叶指纹图谱进行了相似度分析。结果:同-1树龄不同采收期的银杏叶中, 二至四年生银杏叶分别在不同采收期指纹图谱相似度较高(> 0190) ; 五年生和六年生银杏叶分别在不同采收期指纹图谱相似度变化范围较大(0.86～ 0.97)。同-1采收期不同树龄的银杏叶中, 5～ 7 月不同树龄银杏叶指纹图谱相似度较高(> 0.90) ; 8～10 月不同树龄银杏叶指纹图谱相似度变化范围较大(0.84～ 0.99)。结论:本研究为控制邳州银杏叶内在质量建立了指纹图谱方法, 为银杏叶的合理采收提供了科学依据。
关键词: 银杏叶; HPLC; 指纹图谱; 计算机辅助相似性评价系统; 相似度
银杏叶为银杏科植物银杏Ginkg o biloba L. 的干燥叶[ 1 ]。银杏叶主要含黄酮类(f lavono ids) 和萜烯内酯类( terpenes) 化合物, 具有扩张血管、改善脑循环、抑制血小板活化因子(PA F) 作用。曾经制定了邳州银杏叶黄酮类成分和内酯类成分测定方法, 并对其化学成分进行了系统的分析评价研究[ 2～ 4 ] , 但是由于银杏叶中成分呈复杂化、多样化特性, 仅几个指标成分的测定不能全面反应其内在质量, 而指纹图谱能够全面反应银杏叶所含化学成分的种类、数量及相互之间的比例, 进而有效地表征其内在质量。本实验以梯度洗脱方法建立了银杏叶指纹图谱, 方法学研究表明该法稳定性好, 可操作性强, 为全面控制银杏叶质量提供了实验依据。通过不同树龄银杏叶在不同采收期指纹图谱相似度分析, 为合理采集银杏叶提供指导。
1 仪器与试药
W aters 高效液相色谱仪(A lliance 2695 四元泵及自动进样系统, 996 二极管阵列检测器, Empow er 色谱工作站) ; KQ —250E 型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司) ;M illipo re 纯水器。乙腈(HPLC) , 磷酸(AR ) , 超纯水, 其他试剂均为分析纯。
药材采自邳州银杏叶生产基地港上、铁富两镇,每样在同-1实验田采集3 个点, 每-1点采集3～ 6 株银杏叶全株, 混匀, 置阴凉通风处, 晾至近干, 置干燥箱于50℃烘干, 真空包装, 于避光、阴凉处存放。
2 方法与结果
2.1 色谱条件: 色谱柱: A llt im a C18柱(250 mm ×4. 6 mm , 5μm ) ; 流动相: 乙腈(A ) -0.5% 磷酸水(B) 进行梯度洗脱, 15%～ 27% A (0～40 m in) ,27%～ 15% A ( 40～ 60 m in ) , 15% A ( 60～75m in ) ; 体积流量: 1 mL öm in; 检测波长: 360 nm; 柱温: 20 ℃。
2.2 供试品溶液的制备[ 4 ]: 称取四年生银杏叶8 月中旬采集样品粉末1.0 g, 置100 mL 三角烧瓶中,加入25 mL 50% 乙醇, 超声处理40 m in, 取上清液, 滤过, 即得。
2.3 精密度试验: 取同-1供试品溶液, 连续进样5次, 考察各色谱峰的相似度, 结果表明: 5 张色谱图与其共有模式的相似度分别为0.997、0.996、0.995、0.999、0.998, 说明仪器的精密度较好。
2.4 重现性试验: 取供试品5 份, 分别按供试品制备方法制备, 进样, 测定, 考察色谱峰的相似度, 结果表明: 5 个供试品色谱图与其共有模式的相似度分别为0.994、0.994、0.999、0.999、0.995, 说明该法重现性较好。
2.5 稳定性试验: 取供试品溶液分别在0、4、8、12、16、20、24 h 进行测定, 考察色谱峰与其共有模式比较的相似度, 结果表明: 不同时间点采集的色谱峰相似度分别为0.996、0.992、0.983、0.996、0.995、0.999、0.998, 说明供试品溶液在24 h 内稳定性较好。
2.6 样品测定: 将不同树龄银杏叶在不同采收期采集的35 批样品分别制备供试品溶液, 进样20 μL ,按选定的HPLC 色谱条件分析测定, 采集60 m in的数据, 并将采集的数据导出, 供计算机辅助相似性评价系统进行评价。
2.7 应用计算机辅助相似性评价系进行数据处理:将采集的数据导入中药指纹图谱相似度计算软件(V er 1. 315, 中南大学中药现代化研究中心研制) ,经数据剪切、等长处理、数据平移, 然后将谱峰进行自动匹配, 接着进行全谱相似度分析。求出各谱峰的共有模式(同-1树龄的银杏叶不同采收期指纹图谱共有模式图和同-1采收期不同树龄的银杏叶指纹图谱共有模式图各选出1 张代表性图谱, 见图1、2) 及各谱峰与共有模式比较的相似度, 结果见表1、2。
2.8 结果
2.8.1 由表1 可以看出, 同-1树龄不同采收期的银杏叶相似度评价中, 二至四年生银杏叶不同采收期样品指纹图谱相似度较高(大于0.90) ; 五年生和六年生银杏叶不同采收期样品指纹图谱相似度变化范围较大(0.86～ 0.97)。提示二至四年生银杏叶分别在5～ 10 月不同的生长期所含成分虽然有差异,但成分的组成和比例有较好的-1致性; 五年生和六年生银杏叶分别在5～ 10 月份不同的生长期成分的组成和比例有-1定的变化。
2.8.2 由表2 可以看出, 同-1采收期不同树龄的银杏叶指纹图谱相似度评价中, 5～ 7 月不同树龄银杏叶指纹图谱相似度较高(大于0.90) ; 8～ 10 月不同树龄银杏叶指纹图谱相似度变化范围较大(0.84～0.99)。提示不同树龄银杏叶分别在5～ 7 月所含成分的组成和比例有较好的-1致性, 8～ 10 月所含成分的组成和比例有-1定的变化。鉴于邳州银杏叶生产基地药农传统采药时间为8 月底到9 月初, 为了保证所采集银杏叶质量有较好的-1致性, 建议采叶时间提前到7 月份。
3 讨论
3.1 银杏叶高效液相色谱图可分离出90 多个峰,如果按照国家药典委员会关于“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行) 的通知”进行谱峰分析, 计算共有峰相对保留时间和相对峰面积, 面积小的峰就会作为非共有峰或未被识别出来, 这样部分信息会被丢失, 而采用计算机辅助相似性评价系统软件进行全谱相似度计算, 对每-1个采集点信息进行处理, 能全面反映谱峰之间的相似关系。3.2 在方法学考察中, 本研究对精密度、稳定性、重现性实验数据应用相似度软件处理, 结果相似度均应在0190 以上, 符合指纹图谱研究技术要求。
3.3 将不同树龄银杏叶在不同采收期采集的35批样品进行相似度分析, 剔除相似度小于0.90 的样品, 建立相似度大于0.90 的样品共有模式, 作为邳州银杏叶的标准指纹图谱, 以此作为银杏叶投料标准。
References:
[ 1 ] Ch P (中国药典) [S ]1 Vo l. É. 2005
[ 2 ] Ju J M , Duan J A , Q ian D W , et al. A study on the changing rules fo r to tal flavono ids and to tal terpene lactones in Ginkg o biloba leaves in different p lanting models and growing seasons [J ]. Ch in J P harm A nal (药物分析杂志) , 2003, 23(3) : 195-198
[ 3 ] Q ian D W , Ju J M , Zhu L Y, et al. Study on changing rules fo r to tal flavono ids and to tal terpene lactones in Ginkg o biloba leaves at different ages of tree and co llecting seasons [J ].Ch in T rad it H erb D rug s (中草药) , 2002, 33 ( 11) : 1025-1027
[ 4 ] Q ian D W , Ju J M , Zhu L Y, et al. A nalysis of to tal flavono ids and to tal terpene lactones in Ginkg o biloba leaves in P izhou [J ]. R es P ract GA P (GA P 研究与实践) , 2002, 2(1) : 36-38
[ 5 ] You S, W ang L , J iang Y H, et al. Research on fingerp rint chromatography of Ginkg o biloba leaves injection [J ]. Ch in T rad it H erb D rug s (中草药) , 2002, 33 (3) : 216-218
作者:鞠建明, 段金廒, 钱大玮, 朱玲英, 张绍君, 郭巧生