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摘要: 目的 研究葛根超微饮片的HPLC 指纹图谱, 考察其有效成分及含量, 为葛根的质量控制提供可靠方法。方法 以大连依利特公司Hypersil BDS C18 (4.6 mm ×200 mm , 5μm) 柱为色谱柱。以乙腈-水为流动相进行二元梯度洗脱, 柱温为25 ℃, 流速为1.0 mL /min, 检测波长为250 nm。结果 初步建立了葛根超微饮片的HPLC 指纹图谱, 标定了11 个共有峰。结论 利用HPLC 指纹图谱可以较全面的控制葛根超微饮片的内在质量。
关键词: 葛根超微饮片; HPLC 指纹图谱; 高效液相色谱法
葛根为豆科植物野葛Puerariae lobata (Willd. ) Ohwi或甘葛藤Puerariae thomsoni i Benth. 的干燥根。具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻的作用[1 ] 。本实验以葛根素为对照品对17 批不同地区的商品葛根药材制成的超微饮片进行测定, 并进行方法学考察, 初步建立了其指纹图谱, 为野葛标定了11 个共有指纹峰, 粉葛标定了7 个共有峰。
1 仪器与试药
Waters 高效液相色谱仪(配有Waters 510 输液泵, Waters 484 紫外检测器, Waters 输液泵控制器) 。葛根素对照品(批号752-200108 , 供含量测定用, 中国药品生物制品检定所提供) ; 乙腈为色谱纯; 水为重蒸水; 其余试剂为分析纯。17批商品葛根药材购自四川、杭州、甘肃、北京、湖南等地,经湖南中医药研究院中药研究所生药室谢昭明研究员鉴定分别为野葛Puerariae L obata (Wi l l d. ) Ohwi. 和甘葛藤Puerariae thomsoni i Benth , 分别加工成超微饮片。
2 方法与结果
2.1 供试品溶液的制备
分别精密称取粉葛超微饮片粉末0.8 g (共12 批) 和野葛超微饮片粉末0.2 g (共5 批) , 置50 mL 量瓶中, 加30 %的乙醇约50 mL , 超声处理30 min , 放冷, 用30 %的乙醇精密加至刻度, 0.45μm 微孔滤膜滤过, 即得。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取葛根素对照品2.5 mg 于25 mL 的容量瓶中,加30 %的乙醇定容至刻度, 摇匀, 即得。
2.3 色谱条件
色谱柱为大连依利特公司Hypersil BDS C18柱(4.6 mm ×200 mm, 5μm) ; 流动相为乙腈-水二元梯度洗脱(洗脱程序见表1) ; 柱温为25 ℃; 流速为1.0 mL /min ; 检测波长为250nm。该条件下野葛、粉葛均获得较好的分离, 见图1～图2 。
洗脱程序：0 min A (乙腈) % 2 B (水) % 98；7 min A (乙腈) % 2 B (水) %98；60 min A (乙腈) % 2 B (水) % 74
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验：取同一份葛根(安徽产野葛) 超微饮片的供试品连续进样5 次, 比较共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积, 结果表明各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致, RSD < 2 % (见表2～表3) , 符合指纹图谱的检测要求。
2.4.2 稳定性试验：取同一份葛根超微饮片(野葛) 的供试品溶液, 分别在制备后1 、4 、8 、16 、24 、48 h 进样, 比较各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积, 结果表明各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致, RSD <2 % , 表明样品在48 h 内稳定, 符合指纹图谱的检测要求。
2.4.3 重现性试验：取同一批葛根(野葛) 超微饮片样品5 份, 按供试品溶液制备方法分别制备供试品溶液, 比较各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积, 结果表明各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致, RSD < 2 % ,符合指纹图谱的检测要求。
2.5 指纹图谱的建立
2.5.1 共有指纹峰的标定：采用相对保留时间标定共有指纹峰: 以图谱中葛根素为参照物(S) , 将各色谱峰保留时间与同一图谱中参照物的保留时间比较, 其比值为各色谱峰的相对保留时间。分别计算5 批野葛、10 批粉葛样品的指纹图谱中各色谱峰的相对保留时间和峰面积, 其中11 个色谱峰为野葛共有(见表4) , 7 个色谱峰为粉葛共有(见表5) 。因此, 标定它们为共有指纹峰。其中以葛根素参照峰(S) 计算, 野葛共有指纹峰的相对保留时间为: 峰1 (0.123 9) ,峰2(0.747 5) , 峰3 (0.861 8) , 峰4 (0.950 3) ,峰S(1.000 0) ,峰6(1.047 4) , 峰7 (1.072 4) , 峰8 (1.144 1) ,峰9(1.164 7) ,峰10(1.252 7) , 峰11 (2.246 9) 。粉葛共有指纹峰的相对保留时间为: 峰1 (0.092 8) , 峰2 (0.126 3) , 峰S (1.000 0) , 峰4(1.151 0) , 峰5 (1.222 0) , 峰6 (1.276 1) , 峰7 (1.756 9) 。
2.5.2 共有指纹峰的相对峰面积：以图谱中葛根素为参照物(S) , 将各共有指纹峰峰面积与同一图谱中参照物的峰面积比较, 其比值为各共有指纹峰的相对峰面积。根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》的规定[2 ] , 单峰峰面积占总峰面积< 10 %时, 峰面积比值不作要求, 仅需标定相对保留时间。但在实验里我们把所有的峰面积全部标定, 结果见表6～表7 。
2.6 葛根超微饮片中葛根素的含量测定
2.6.1 葛根素线性关系考察与含量测定：照中国药典2000版一部[1 ] 葛根项下的含量测定条件, 精密量取配置好的葛根素对照品的不同浓度溶液, 进样测定, 以葛根素进样量( X) 为横坐标, 以峰面积响应值( Y) 为纵坐标, 绘标准曲线, 得回归方程: Y = 450 388 X + 30 494 ( r = 0.999 5) 。葛根素在0.28～1.68μg 与峰面积呈良好的线性关系。精密吸取对照品溶液10 μL , 供试品溶液10 μL , 分别注入高效液相色谱仪, 测定峰面积, 计算, 即得。
2.7 相似度计算
采用中南大学“计算机辅助相似性评价系统”进行相似度计算。数据压缩5 000 ×11 , 压缩层数2 ; 使用移动窗口多项式最小二乘拟合平滑; 使用三标准峰平移; 所有指纹图谱采用同一阈值0.02 ; 自动谱峰匹配。相似度计算结果见图3～图4 。
2.8 不同植物来源的葛根
野葛与甘葛藤的指纹比较(见图5) 。
3 讨论
超微饮片是我院研制的一种微米级新型中药饮片, 因其原药材的形状、显微特征已不存在, 采用指纹图谱技术来控制其质量具有较强的专属性。
本试验所用的对照品为葛根素, 参照中国药典中葛根素下的含量测定方法[1 ]制备供试品溶液, 参照文献[3～4 ] , 试验出选择乙腈-水二元梯度洗脱(2 ∶98～26 ∶74) (检测波长为250nm)的分离效果比较好, 保留时间也适合。
对17 批不同商品地的葛根超微饮片进行了葛根素的含量测定, 结果表明葛根超微饮片因原料品种与产地的不同,其有效成分的含量也有较大的差异: 野葛超微饮片的葛根素含量较粉葛超微饮片的含量要高10 倍。不同植物来源的葛根超微饮片HPLC 指纹图谱差别较大。野葛与粉葛的指纹图谱比较可知它们在峰的个数及峰的相对强度方面均有区别, 野葛HPLC 图谱峰比粉葛多。
相似度计算结果表明, 4 组相似度的参数均在0.9 以上, 说明建立的指纹图谱相似度较好。
参考文献
[1 ] 中国药典2000 年版. 一部[ S] . 2000. 273
[2 ] 国家药品监督管理局. 中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行) [J ] . 中草药, 2000 , 22 (10) : 671
[3 ] 方继辉, 朱炳辉, 余锦雄, 等. SPE2HPLC 法测定中成药中葛根素的含量[J ] . 中药新药与临床药理, 2004 , 15 (3) : 187
[4 ] 何春年, 李敏, 曹志高, 等. 葛根药材HPLC 指纹图谱研究[J ] . 中国中药杂志, 2003 , 28 (12) : 1141
来源:中南药学2005 年4 月第3 卷第2 期
作者:蔡光先, 李顺祥, 蒋炜