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摘要: 目的: 建立葛根(野葛) 的高效液相色谱(HPLC) 指纹图谱。方法: 用反相高效液相色谱(RP- HPLC)DAD 法测定葛根的指纹图谱, 并作相似度比较分析。结果: 初步建立了葛根的指纹图谱。结论: HPLC 指纹图谱法重现性好, 可作为葛根的一项质控指标。
关键词: 葛根; 指纹图谱; 高效液相色谱法
葛根为常用中药, 系豆科植物野葛P ueraia lobata (W illd. )O -hw i. 或甘葛藤P ueraria thom sonii Benth. 的干燥根, 具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻之功效, 临床常用于外感发热头痛、项背强痛, 口渴, 消渴, 麻疹不透, 热痢, 泄泻, 以及高血压颈项强痛等症状[1 ]。现代研究表明[2 ] , 葛根主要含有葛根素、黄豆苷、黄豆苷元等有效成分, 具有调节心脏功能及代谢、扩张冠状血管和脑血管、抗心脑缺血和心律失常、降血压、降血糖和血脂等药理作用。
据记载和调查, 除上述2 种外, 同属一些其他植物的根在少数地区也作葛根入药。据成分检测, 其他种葛根素含量甚微或无, 不宜药用。为了进一步探讨葛根的鉴别特征, 有助于规范用药, 本文采用高效液相色谱法对葛根(野葛) 指纹图谱的构建进行了初步研究, 以期为葛根的药材鉴别、质量评价以及质控标准制定提供依据。
1 仪器与试药
A gilent 1100 液相色谱仪(自动进样器) ,DAD 检测器。葛根素对照品为实验室自制。重蒸去离子水(实验室制备) ,甲醇(上海化学试剂有限公司, 分析纯; Tedia 公司, 色谱纯) , 乙醇(上海化学试剂有限公司, 分析纯)。
葛根采自浙江杭州、浙江湖州、湖南、河南、广东等地或市售品, 采购时间为2002211, 共10 份样品, 经笔者鉴定均为豆科植物野葛P ueraria lobata (W illd. )O hw i. 的干燥根。
2 方法与结果
2. 1 供试品的制备
精密称取葛根药材粗粉0. 1 g, 置锥形瓶中,精密加入30% 乙醇50m l, 称定重量, 加热回流30m in, 放冷, 再称定重量, 用30% 乙醇补足减失的重量, 滤过, 取续滤液, 用微孔滤膜(孔径为0. 45um) 滤过, 滤液作为供试品。
2. 2 参照物的制备
精密称取葛根素对照品, 加甲醇制成每1 m l甲醇含葛根素0. 2 mg 的溶液, 作为参照物。
2. 3 色谱条件
色谱柱为A gilent ZORBAX 80A Extend- C18分析柱(250 mm ×4. 6 mm , 5um) ; 流动相为75% 水溶液与25% 甲醇洗脱; 流速1. 0 m l/m in; 柱温25℃; 检测波长250 nm; 参比波长360 nm; 分析时间30 m in; 供试品及参照物进样量各20uL。
2. 4 方法学考察
2. 4. 1 稳定性实验：取同一批次供试品(湖州样品) , 分别在0, 2,4, 8, 16, 24, 36 h 测定指纹图谱, 用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算, 结果相似度均大于0. 94, 表明供试品在测定的36 h 内保持稳定。
2. 4. 2 精密度实验取：同一批次供试品(湖州样品) , 连续进样5次, 测定指纹图谱, 考查进样精密度, 用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算, 结果相似度均大于0. 97, 表明供试品进样精密度良好。
2. 4. 3 重现性实验：取湖州样品, 按供试品制备方法分别制备5份供试品, 测定指纹图谱, 用“中药指纹图谱相似度计算软件”计算, 结果相似度均大于0. 93, 表明本法测定的重现性良好。
2. 5 指纹图谱的建立：取供试品溶液适量, 注入液相色谱仪, 按选定的测定条件, 进行检测。同一上述实验条件下, 测定所有供试品HPLC 色谱图。根据10 批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值(积分值)和峰位(相对保留时间) 等相关参数, 进行分析、比较, 制定优化的指纹图谱。图1, 图2。
2. 6 指纹图谱分析与评价：葛根高效液相色谱可分离出约10 多个色谱峰, 经与参照物对照以及比较所有测定和记录的色谱图,选取其中6 个共有峰作为指纹图谱的特征峰。其保留时间(m in)、峰面积如下。
2. 6. 1 共有指纹峰标定：根据10 批次供试品测定结果, 标定共有指纹峰。葛根HPLC 指纹图谱中, 共有指纹峰6 个。与葛根素参照物峰(3 号峰) 相比, 其它5 个共有指纹峰相对保留时间依次为:0. 270, 0. 555, 1. 144, 1. 360, 1. 637。
2. 6. 2 共有指纹峰面积比：除葛根素参照物峰以外, 2、4 号共有指纹峰面积(峰) 超过总峰面积的10% , 规定2 号峰相对峰面积比值为0. 176 0～ 0. 326 9, 规定4 号峰相对峰面积比值为0. 211 1～0. 392 0。
2. 6. 3 相似度评价：将测试数据导入中药指纹图谱相似度计算软件, 经选峰, 设定匹配模板, 将谱峰自动匹配; 然后设定标准模板, 进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。通过中药指纹图谱相似度计算软件得出葛根HPLC 指纹谱共有模式; 与共有模式比较, 不同产地葛根的相似度: 浙江杭州0. 95, 浙江湖州0. 92, 湖南0. 89, 河南0. 85, 广东0. 90, 亳州药市0. 87, 南京药店0. 86。
3 讨论
3. 1 本实验对供试品制备、色谱条件进行了优化选择。通过对不同提取溶剂、提取方法进行实验比较, 对所得指纹图谱进行反复考察, 并结合葛根主含成分的性质, 拟定上述供试品的制备方法。经实验比较, 选择75% 水溶液与25% 甲醇为流动相, 能较好地使样品中各色谱峰分离且出峰最多; 分析时间30 m in, 样品1. 5 h图谱显示, 30m in 后无特征峰出现。采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察, 记录并比较不同波长的色谱图, 结果在250 nm检测波长下, 色谱图中色谱峰较多, 信息丰富, 故确立250 nm 为检验波长。
3. 2 据记载和调查, 除《中国药典》收载的2 个品种外, 同属一些其他植物的根, 如食用葛P. ed u lis, 三裂叶葛藤P. p haseoloid es,山葛P. m ontana, 峨嵋葛P. om eiensis 等, 在少数地区也作葛根入药, 由于这些品种葛根素含量甚微或无, 可以推断其指纹图谱中葛根素这一主要共有特征峰不明显或无, 以资进行品种鉴别。本实验仅对葛根(野葛)HPLC 指纹图谱的构建进行了初步研究, 仍需收集不同品种、不同产地的大量样品, 进行系统、规范化的深入研究。
参考文献:
[ 1 ] 国家药典委员会. 中国药典, É 部[ S ]. 北京: 化学工业出版社,2000: 273-274.
[ 2 ] 肖培根. 新编中药志, 第1 卷[M ]. 北京: 化学工业出版社, 2002:926-970.
作者:陈斌, 刘训红, 蔡宝昌
来源:时珍国医国药2005 年第16 卷第5 期