葛根药用成分异黄酮的HPLC指纹图谱分析

摘要：采用高效液相色谱法对葛属植物野葛和粉葛块根的主要药用成分异黄酮化合物的指纹图谱进行了研究。结果表明，以乙腈-0.5%乙酸为流动相，采用梯度洗脱的方法，葛根异黄酮化合物的各种组分可得到良好的分离；通过对10批次野葛药材HPLC图谱的检测，共确定了15个色谱峰作为野葛的共有指纹峰，根据中药指纹图谱技术的基本原则和方法，建立了野葛的HPLC指纹图谱；与不同产地野葛的HPLC图谱的比较，供试样品的指纹图谱基本一致；而与粉葛样品的HPLC图谱存在较大的差异；表明得到的色谱图可以作为野葛药材专属性的指纹图谱，为葛根的药材鉴别和质量控制提供了实验依据。
关键词：葛根；异黄酮；指纹图谱；高效液相色谱
葛属植物野葛[Puerarialobata(Willd.) Ohwi.]和粉葛（P.thomsonii Benth.）广泛分布于亚洲东南部、马来西亚、印度尼西亚和美洲大陆等湿润热带和亚热带地区，它的块根常作药用，其主要生物活性成分为葛根素（puerarin）、大豆甙（daidzin）、大豆甙元（daidzein）和3’-甲氧基葛根素（3’-methoxypuerarin）等异黄酮类化合物。全世界已知的葛属植物大约有18种，我国是葛属植物的原产地之一，分布极其广泛。吴德邻等通过野外考察，对我国葛属植物腊叶标本、同工酶和染色体组进行了研究，将中国葛属植物划分为9个种和2个变种，其中7种与药用有关。顾志平等测定了不同葛属植物中异黄酮及其组分的含量，研究结果表明，不同葛属植物中药用成分异黄酮含量和组分差异显著，以野葛和粉葛为高；而有些葛属植物（如云南葛藤）则具有毒性。由于葛属植物大多具块根，外形相似，易造成葛根药材流通和利用过程中的混杂，并且不同葛属植物和不同产地葛根药材的有效成分含量差异显著；从而给用药安全和药材质量带来影响。中药提取物与化学合成药的最根本区别在于它是多种化学成分的混合体。经过长期的植物化学和药理药效研究，人们越来越认识到中药的药效不是来自任何单一的活性成分，而基本上是多种活性成分。因此，采用任何单一的活性成份或指标成份都难以准确地评判中药的真伪和优劣，这给传统的中药质量评价方法即采用单一的化学成分定性和定量的有效性和专属性提出了质疑。采用色谱指纹图谱技术（在固定的实验条件和实验方法下，得到同种药材不同批次样品的色谱图谱，经对比分析，得到能够确定该药材的共有峰的图谱信息，作为同种药材之共性以鉴别药材的品质），有望显著改善中药质量的可控性，提高中药产品的现代化内涵和生产现代化程度。美国FDA草药保健品的申报资料、WHO草药评价指导原则和欧共体草药质量指南等均认可色谱指纹图谱作为中药鉴别和质量评价的重要方法。因此，笔者采用高效液相色谱法（HPLC）对野葛、粉葛块根中异黄酮指纹图谱进行了研究，为葛根的药材鉴别和质量控制提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试野葛药材分别取自安徽舒城、九华山、金寨、歙县和陕西关中，粉葛药材取自安徽泾县。
1.2 方法
1.2.1 仪器与试剂Waters600 型高效液相色谱仪，7725i进样阀，SGE 25μL微量进样针（Australia），2847 双波长紫外检测器，Millinum32软件，T6328B型万分之一电子天平（上海）。乙腈和乙酸为色谱纯（TEDIA 公司），葛根素购于中国药品生物制品检定所，大豆甙、大豆甙元和3’-甲氧基葛根素为供定性分析用的化学对照品；水为去离子石英双重蒸馏0.45μm膜过滤水，其他试剂为国产分析纯。
1.2.2 色谱条件色谱柱Hypersil ODS 250mm×4.6mm C18 柱，吸附剂颗粒直径5μm，柱温（25±1）℃；流动相为乙腈（A相）和0.5%乙酸（B 相），梯度洗脱，0.40 min A 相0%～30%，B 相100%～70%，40～60min A 相30 %～40 %，B 相70%～60%，流速1mL/min；检测波长为250nm，检测时间为20min，进样量10μL 。
1.2.3 供试样品溶液的制备分别取适量采集的野葛和粉葛材料，清水洗净，切片，60℃烘干，粉碎备用。测试前将样品60℃再烘至恒重，精密称取野葛样品粉末0.1g，粉葛样品0.2g，精确加入体积分数70%乙醇20mL，超声处理60min，自然冷却，加体积分数70%乙醇补足损失的质量，静置浸提48h；取上清液用0.45μm 微孔滤膜过滤，再用超纯水将滤液稀释10 倍，即得供试样品溶液。不立即分析的样品溶液可暂时放于4℃冰箱保存。
1.2.4 对照品溶液的制备精密称取葛根素对照品25mg，加甲醇定容至25mL，配制成质量浓度为1mg/mL的贮备母液。精密移取贮备母液2mL 置10mL 容量瓶中，超纯水定容至10mL，摇匀，即得葛根素质量浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。以同法配制大豆甙、大豆甙元和3’!甲氧基葛根素对照品溶液。
1.2.5 检测方法取对照品溶液、野葛和粉葛供试样品溶液各10μL进样分析，记录60min 的色谱图；采用Millinum32软件分析，获取谱图中各峰的保留时间和峰面积数值。以葛根素对照品的色谱峰来确定供试样品溶液中的葛根素的色谱峰（S峰），以供试样品S峰的保留时间为1计算各峰相对保留时间，以供试样品S峰面积为1 计算各峰面积的比值。
2 结果与分析
2.1 检测方法的检验
2.1.1 精密度试验取同一供试样品溶液，分别连续进样5次，检测供试样品溶液的指纹图谱。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和单峰面积大于或等于10%总峰面积的色谱峰峰面积的比值的相对标准偏差RSD（%）分别为0.00%～0.17%和0.00%～4.59%，符合指纹图谱的要求。
2.1.2 稳定性试验取同一供试样品粉末，按供试样品溶液制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，8，16 h 检测指纹图。结果显示，各色谱峰的相对保留时间和单峰面积大于或等于10%总峰面积的色谱峰峰面积的比值没有明显的变化。因此，低温保存下的葛根制备样品溶液稳定性较好。
2.1.3 重现性试验取同一批号的供试样品粉末5份，按照供试品溶液的制备和检测方法制备样品溶液并进行检测。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD（%）分别为0.00%～0.29%，各共有峰的相对保留时间和单峰面积大于或等于10 %总峰面积的色谱峰面积的比值基本一致，符合指纹图谱的要求。
2.2 指纹图谱及技术参数
2.2.1 指纹图谱及共有指纹峰的标定按照对照品和供试品溶液的制备和检测方法制备样品溶液，并对4种对照品和10批次野葛药材供试品的HPLC 图谱进行了检测。结果表明，1，2，3，S ，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14峰在10批次样品的色谱图中均出现；以葛根素对照品保留时间为参照，计算各共有指纹峰的相对保留时间；相对保留时间的RSD（%）为0.00%～0.16%（n=10）之间；其指纹峰面积之和占总峰面积比值均大于90%，因此标定此15个峰为共有指纹峰，并据此建立了野葛的HPLC指纹图谱。
2.2.2 共有指纹峰面积与葛根素对照品峰面积的比值以葛根素对照品峰面积为参照，计算10批次药材供试品各共有指纹峰的峰面积比值及其差值；由表可见，各批次供试品指纹图谱的重现性较好，各共有指纹峰的面积比值相对固定，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行）。
2.2.3 非共有峰面积供试的10批次样品共有指纹峰面积之和占总峰面积比值平均为97.11%， 则非共有峰面积占总峰面积的比值平均为2.89%，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行）。
2.3 指纹图谱的检验
2.3.1 不同产地野葛药材HPLC图谱的比较取5个不同产地野葛药材，按供试品及其溶液的制备法制备供试样品溶液并按供试品检测法进行检测，结果显示，野葛HPLC指纹图谱中标定的各指纹峰在不同产地野葛药材供试品HPLC 图谱中均有良好的重现性。
2.3.2 野葛与粉葛HPLC 图谱的比较取野葛和粉葛药材，按供试品及其溶液的制备法制备供试样品溶液并按供试品检测法进行检测，结果表明，野葛和粉葛供试样品异黄酮化合物的HPLC 图谱有较大的相似性，但粉葛缺少野葛5，9和12共3个指纹峰；同时，粉葛样品共有指纹峰的峰面积百分比与野葛样品相对应的色谱指纹峰的峰面积百分比有较大的差异。这表明得到的野葛HPLC色谱图可以作为野葛药材专属性的指纹图谱。
3 讨论
采用HPLC 技术对葛根药材中异黄酮化合物进行了检测，通过10批次野葛药材样品的色谱峰保留时间和峰面积百分比的比较和分析，对共有指纹峰进行了标定，并据此成功建立了野葛药材的HPLC指纹图谱。经与不同产地野葛样品和粉葛样品的HPLC 图谱的比较，结果表明，实验获得的色谱指纹图谱在不同产地野葛样品中具有极大的相似性，并能据此与粉葛品种进行有效的区分；从而可以有效反映野葛药材成分特征的唯一性和同一物种个体间的相似性，可以作为野葛药材专属性的指纹图谱。全世界葛属植物大约有18种，而本实验仅选取了其中的2种（即野葛和粉葛）。以指纹图谱作为葛根的药材鉴别和质量评价的方法和依据，尚需结合其他葛属植物尤其是我国特有种的异黄酮组分检测及其指纹图谱分析，比较不同葛属植物间异黄酮组分指纹图谱的差异，并找出各自专属性的指纹图谱，提供更加全面、准确和典型的图谱信息；从而建立起符合现代化、国际化规范的葛根药材质量与安全性控制标准。