摘要:目的:建立知母药材的HPLC
指纹图谱并对图谱进行评价。方法:采用HPLC法对知母水提液正丁醇萃取物作指纹图谱,用相似度软件评价其相似性。结果:经相似度软件评价,同一产地知母药材的指纹图谱有较好的相似性,不同产地之间有一定差异。结论:本研究能对知母药材更科学有效地控制其质量。
主题词:知母/分析;色谱法;高压液相
《中国药典》(2000年版171页)记载的知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge. 的干燥根茎,春秋两季采挖,除去须根及泥沙,晒干,习称“毛知母”;除去外皮,晒干,习称“知母肉”。文献研究表明,知母主产于河北省,主要含知母甙约6%,从中检出6种皂甙。另外知母根茎中还含有芒果甙、菝葜皂甙元等多种皂甙元、知母多糖以及多种金属元素。知母皂甙的提取工艺多采用经典的醇提、脱脂、正丁醇萃取、丙酮重结晶方法。药理研究表明,知母总皂甙能抑制Na+ - k+ - ATP酶活性,知母多糖有降血糖的作用,具有清热泻火、生津润燥之功效。知母研究通常采用薄层扫描法或高效液相色谱法测定菝葜皂甙元、萨尔萨皂甙元的含量。然而,单一的某一成分含量测定不能完全反映
中药的药效作用。指纹图谱技术是目前反映中药作用机理的最有效途径,也是中药现代化的关键技术之一,指纹图谱质量控制技术是中药质量控制最先进的技术。本文按现行大多数中成药最常用的水提方法,提取中药材知母的水溶成分经正丁醇萃取后做指纹图谱。实验证明这样做出的指纹图谱不仅能反应中药材知母的大多数有效成分,而且能从图谱中的信息有效地控制中药材知母的质量。并成功运用指纹图谱(国家药典委员会推荐试用中药指纹图谱相似度计算软件之一)计算出各自的相似
度,说明其专属性和可行性。
1 实验材料
1. 1 样品 本研究共收集河北、河南、湖南和安徽产知母药材样品14个。1号样品产自河南嵩县,2号样品产自湖南岳阳,3号样品产自河北安国, 4号样品产自河北安国,5号样品产自河北安国, 6号样品产自河北安国, 7号样品产自河北安国, 8号样品产自河北博野, 9号样品产自河北安国, 10号样品产自河北博野, 11号样品产自河北安国, 12号样品产自河北安国, 13号样品产自安徽, 14号样品产自安徽。
1. 2 仪器 Agilent 1100 Series系列高效液相色谱仪;分析软件: HP色谱工作站软件, HP三维光谱软件,计算机辅助相似性评价系统(中南大学中药现代化研究中心) ;色谱柱:Hydrosphere C18,S-5μm,12nm,250×4.6mm;流动相:乙腈-0.01%磷酸二元梯度洗脱; 流速1ml/min; 检测波长236nm;柱温:30℃。主要试剂:甲醇、乙腈、醋酸乙酯、二次蒸馏水、磷酸。其中乙腈为色谱纯,甲醇为色谱纯和分析纯,其余均为分析纯。
1. 3 供试品的制备及测定法 称取知母10g,加蒸馏水80ml回流提取2h,冷却后滤纸过滤,滤液用50ml正丁醇萃取1次,正丁醇层蒸干,残渣用甲醇适量溶解,定容置10ml。精密吸取供试液10ul,收集60min的色谱图。
2 指纹图谱的建立
知母指纹图谱特征是在HPLC指纹图谱上主要有5个特征峰,为了便于分析,把整张图谱分成I、II两个区域。其中I区是特征区,典型的特征是3号峰为一特强峰, 1号、2号、3号峰依次增强。II区是指纹区, 4号指纹峰为一组较弱的吸收峰群, 5号指纹峰也由两个弱吸收峰和一个较强吸收峰组成。
3 方法学考察
3. 1 稳定性试验 精密吸取同一样品溶液10μl,每隔1h进样1次,连续7h,结果7h内指纹图谱比较稳定,相似度系数RSD=1.21%。
3. 2 精密度试验 精密吸取同一样品溶液10μl,连续进样6次,相似度系数RSD=1.05%。
3. 3 重现性试验 取同一批号的知母5份供试品,按供试品测定法操作,测定指纹图谱,结果表明,本方法重现性良好,指纹图谱相似度系数RSD=1.81%。
4 结果与讨论
4. 1 由于指纹图谱分析带有综合、宏观、模糊的非线性特性,更能适应中医药传统理论的需要。虽然它不能代替含量测定,但指纹图谱依靠图谱本身提供的丰富信息却能很好的鉴别其品种和来源,说明其道地性。从图2中可以明显看出安徽产知母指纹图谱的特征区内1号峰显著降低, 3号峰完全缺失。
4. 2 本实验通过对14批不同产地知母建立其共有模式并进行相似度计算,结果发现不同产地知母药材有较高的相似度,但也存在有一定差异,如湖南、安徽产知母的相似度均在0.8612以下。
4. 3 对于成分复杂的中药,指纹图谱比测定任何单一成份所提供的信息均要丰富和有用得多,如果能结合药效学和分子化学手段以及计算机辅助相似性评价系统,还可对指纹图谱中与药效有关的信息进行判别,这将使得中药的质量与药效真正吻合,也才有可能较好地解决如何体现中药的整体性和复杂性的难题。
作者：
2006-3-27