山麦冬的HPLC/ESI-MS特征指纹图谱研究

摘要: 目的：研究山麦冬Liriope spicata 甲醇提取物中的物质组成情况,建立山麦冬HPLC/ESI-MS特征指纹图谱。方法：山麦冬用甲醇超声提取, 提取液经C18SPE固相萃取柱除去多糖成分后,用高效液相色谱2电喷雾离子
阱质谱(HPLC/ESI-MS)分析提取物中的物质组成。结果：山麦冬甲醇提取物色谱图中有17个共有峰的重现性与精密度的RSD<5%,建议以此为基础制作山麦冬特征指纹图谱。结论：应用HPLC/ESI-MS技术建立的山麦冬指纹图谱特征性强、重现性较好,可用于山麦冬的品质评价与品种鉴别。
关键词:湖北麦冬;高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱;指纹图谱
山麦冬为百合科植物湖北麦冬Liriope spica ta(Thunb.) Lou r. var. prolifera Y. T. Ma和短葶山麦冬L. m usca ri (Decne. ) Bailey 的干燥块根,主要成分有三萜皂苷、多糖及异黄酮等。由于受产地、气候、生态环境以及采集时间等因素的影响,不同来源山麦冬药材中所含主要成分差异较大。因此,仅针对其中某个有效成分进行定性或定量分析并不能有效控制药材的质量。关于山麦冬、麦冬皂苷类成分提取、结构分析及定量测定研究已有许多文献报道,但未见有关山麦冬皂苷类成分指纹图谱研究的报道。高效液相色谱2质谱联用技术集液相色谱分离能力强和质谱灵敏度高、定性能力强于一体,是用于中药活性成分研究的最有效的分析手段之一[ 8 ]。笔者曾研究了麦冬皂苷提取物的电喷雾质谱特征图谱,本实验应用高效液相色谱2电喷雾离子阱质谱(HPLC/ES I-MS)研究了山麦冬药材甲醇提取物指纹图谱,该指纹图谱特征性强、重现性良好,可用于山麦冬药材的鉴别及质量评价。
1　仪器, 材料与试剂
美国Finnigan 公司LCQDUO 型液质联用仪,包括ESI( 电喷雾电离)源,TSP4000泵及TSPA S3000自动进样器,H ighchem 公司Mass Fron-tier 1.0质谱解析软件。
1～10号药材来源分别为: 1号对照药材,中国药品生物制品检定所,批号11362200001;2号药材2000年3月采于襄阳欧庙山麦冬药材GAP种植基地;3～10号药材于2001年11月采于襄阳欧庙,地点分别为欧庙张东一组、欧庙李垴村一组、欧庙张东三组、欧庙桃圆村一组、欧庙肖州村二组、欧庙肖州村四组、欧庙大洲村二组和欧庙李湾村二组。上述药材经本院植物分类学王万贤教授鉴定为湖北麦冬L. sp ica ta (Thunb. ) Lou r. var. p rolif era Y. T.M a。乙腈为色谱纯, 其他试剂均为分析纯。
2　方法与结果
2.1 　测定条件: 色谱条件: AICHROM TM Reliz Sil C18 色谱柱(150mm×2.1mm,5μm) ,流动相10mmol/L乙酸铵-乙腈(60min 内乙腈体积分数变化为25% →60% ),体积流量0.2mL/min,进样量15μL。质谱条件: 扫描范围m /z 300～1200,离子源喷射电压4.5kV ,毛细管电压-45V ,毛细管温度230℃, 鞘气(N 2)流速50个单位,辅助气(N2)流速10个单位,负离子检测。
2.2　供试液的制备:精密称取山麦冬对照药材粉末0.3g于离心管中,超声提取2次(每次15min),每次加甲醇溶液5mL,离心取上清液,合并两次提取液并用甲醇定容至10mL。取甲醇提取液1mL稀释至20mL 后,加压通过已活化的C18 SPE固相萃取柱,先用10mL 水洗除去多糖等成分,后用甲醇1mL洗脱。收集甲醇洗脱液作为山麦冬对照药材供试液。其他产地药材同法制备。在计算各峰强度时,将各样品中每个峰的峰面积除以对照药材中相应峰的峰面积,得到的比值作为样品中该峰的相对峰面积(Ar)。
2.3　供试液HPLC/ESI-MS 特征图谱: 分别取各山麦冬药材供试液15μL 进样分析,对照药材和2号药材的色谱图。取对照品药材供试液连续进样5次,在峰强大于10%的色谱峰中,保留时间( tR ) 及A r的RSD均小于5% 的共有峰有17个。分析5份平行提取的山麦冬对照药材供试液,上述17个共有峰的tR及Ar的RSD亦小于5%。取空白溶剂15μL ,在同样条件下进样分析,没有发现上述17个共有峰。样1 (对照药材) 中17个共有峰的实验数据见表。
3　讨论
3.1 　共有峰初步定性分析:根据山麦冬样品的ESI-MS负离子全扫描质谱和源碰撞诱导解离( source co llision-induced dissociative, SCID ) 实验,上述17个共有峰均为准分子离子峰[M-H]- 。进一步进行MS-MS 分析表明,除了m/z 655.9峰外。各子离子峰均是母离子峰失去糖基的碎片峰,故初步推断上述共有成分为山麦冬皂苷成分。其中m/z 721.5、853.5、895.4 和1047.5与文献报道的山麦冬皂苷成分的相对分子质量及质谱碎裂规律相同(分别为麦冬皂苷A、薯蓣皂苷元-1-O-β-吡喃夫糖-3-O-α-吡喃鼠李糖苷、25 (S )-鲁斯可皂苷元-1-O -[α-吡喃鼠李糖基(1→2) [β-吡喃木糖基(1→3) ]-β-吡喃夫糖苷和薯蓣皂苷元-3-O-α-吡喃鼠李糖苷-(1→2) ]- α-L -吡喃鼠李糖苷-(1→3) -β-吡喃葡萄糖苷)。因此,可以选择上述17个共有峰作为山麦冬HPLC/E S I-MS指纹图谱的主要分析对象。
3.2　指纹图谱的聚类分析:聚类分析法可通过数学的方法来替代人们主要靠经验和专业知识来进行的传统分类工作,将它用于中药指纹图谱分析,不仅可鉴别出药材的真伪,而且可以对同品种不同产地的药材进行品质评价。本实验选择多元统计分析中的聚类分析方法对各共有峰Ar实验数据(相应的共有峰峰面积数据见表)进行分析, 采用Euclidean距离法计算样品间的距离,用Ward方法进行系统聚类,结果见图。聚类图中纵坐标是样品, 横坐标表示样品间的相似程度。以1号山麦冬对照药材为标准,2～10号样品与之比较进行品质评价,连接它们的纵向线越短,说明这两样品间的差距越小。从该聚类图中可以得到以下结论: 样1为对照药材,样2与之距离最短,说明样2 药材与对照药材最相似;样4、8、10 可聚为一类,与对照药材1的相似性较大;样3、5、6、7、9可聚为一类,其药材均采集于11月,说明采集时间相同的药材具有一定程度的相似性。