丹参有效部位指纹图谱定性和有效成分定量分析方法研究

       摘要：目的：建立丹参的反相高效液相色谱定性和定量分析方法。方法：RP-HPLC Planetsil C18分析柱（150mm×4.6mm,5um），流动相为甲醇-水（45:55），流速为1.0mL/min，检测波长为270nm，柱温为室温。对丹参有效部位（乙醚提取部位）进行指纹图谱定性分析，对丹参中的有效成分丹参酮IIA和隐丹参酮进行定量测定。结果：在色谱条件下，11份不同丹参药材中乙醚有效部位的RP-HPLC指纹图谱中可检出11个相对位置稳定的色谱峰，其中确定出9个共有峰作为定性鉴别的指标峰；丹参药材中丹参酮IIA和隐丹参酮的含量分别为$0.102%～0.494%和0.021%～0.139%。结论：丹参有效部位RP-HPLC指纹图谱定性和有效成分定量分析方法具有较强的针对性和准确性，可用于丹参及其制剂的质量控制。
    关键词:：丹参 丹参酮IIA 隐丹参酮 指纹图谱 反相高效液相色谱法
1 仪器与试药
    Shimadzu LC-2010A高效液相色谱仪，Class-VP色谱工作站。色谱纯甲醇（美国Fisher公司）；水为三重蒸馏水（自制）；其余均为分析纯试剂。供含量测定用丹参酮IIA和隐丹参酮对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号分别为0766-200011，0852-9902）。
    11份丹参药材（见表1）(略)2000年～2002年购自安徽、四川、陕西等6个省、市的丹参栽培地和中药店，经由西安交通大学药学院生药学教研室鉴定，来源、规格等属实。
2方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱：Planetsil C18分析柱（150mm×4.6mm,5um）；流动相：甲醇-水（45：55）；流速为1.0mL/min，检测波长为270nm，柱温为室温。理论塔板数按隐丹参酮计不得低于3000。
2.2分析溶液的制备
2.2.1 对照品溶液：精密称取丹参酮IIA和隐丹参酮对照品适量，分别用甲醇溶解并稀释成24ug/ml
与.23.5ug/ml的对照品储备液，对照品溶液由此稀释得到。
2.2.2供试品溶液：精密称取丹参药材细粉0.2，置具塞锥形瓶中，加乙醇50ml，放置过夜，超声提取30min，滤过，挥干后加水20ml转移至分液漏斗中分别用乙醚（20，20，10ml）萃取，萃取液挥干，加甲醇转移并定容至10ml，作为供试品溶液。
2.4 指纹图谱的建立：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪中，记录60min色谱图即得（见图1-B）。比较11批供试品的HPLC图谱发现，其中有6个色谱峰是11批供试品所共有的。计算图谱中各共有色谱峰相对于隐丹参酮色谱峰（8号峰）的相对保留时间和相对峰面积值，结果见表2和表3(略)。
2.4.1 分析方法学考察
    线性关系：分别精密吸取不同体积的丹参酮IIA和隐丹参酮对照品储备液，用甲醇稀释调配成系列对照品溶液，分别进样10ul，测定峰面积积分值，以对照品溶液浓度（ug/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得到丹参酮IIA和隐丹参酮线性回归方程分别为：
    Y=2.602×1000X+1.539×1000 r=0.9999
    Y=3.127×1000X+1.594×1000 r=0.9999
    丹参酮IIA在2.4～240UG/ML’，隐丹参酮在2.35～235UG/ML范围内呈良好线性关系。
2.4.2 对照品稳定性试验:取丹参酮IIA和隐丹参酮对照品混合溶液，于配制后的0，2，4，8，12，20，24，48测定，结果表明在.48h内稳定。
2.4.3精密度试验：取同一份丹参供试品溶液10ul重复进样6次，测定峰面积积分值，丹参酮IIA和隐丹参酮的RSD分别为0.67%和0.96%。
2.4.4 重复性试验：取同一份丹参药材5份，平行进行提取测定，求得丹参酮!0和隐丹参酮含量的RSD分别为1.5%和1.6%。
2.4.5 共有峰确定：在11份丹参供试品的HPLC图谱中，由相对保留时间比较稳定的色谱峰（相对偏差小于3%），可以确定的共有峰有9个，其相对保留时间从0.108～2.108；同时分别计算11个样本主要峰的总面积（A总）、平均总面积（a总）以及总面积的相对偏差，舍去总面积相对偏差小于40%的样本（样品编号为(3，4，10)，最后其余样本确定丹参共有峰为1，3，5，6，7，8，9，10，11号峰，作为丹参有效部位指纹图谱定性分析的指标峰。用此定性指标鉴定11个样本，结果所有样本均为丹参药材。色谱图见图2。
2.5有效成分含量测定（略）
3讨论
    RP-HPLC法虽然是一种有效的分离分析方法，但由于丹参药材成分复杂，性质各异，即使在梯度洗脱条件下也很难获得理想的分离结果。加之，梯度洗脱增加了实验操作和重现性难度，而且难以突出地反映药材中与主要药理作用相关的有效成分群，从而在质量控制方面无法有效地作到“ 纲举目张”。本文应用RP-HPLC技术，建立了丹参有效部位指纹图谱定性和有效成分定量的分析方法。这种方法是在物质基础上，以丹参药材中有效部位为质控对象，并利用现代仪器分析技术同时进行定性和定量分析，增强了方法的有效性和针对性。实验中采用等度洗脱方式，色谱条件容易控制，可保证分析结果的重现性。
    在色谱条件下，丹参脂溶性部位的HPLC图谱中可以检出11个色谱峰。通过对11份丹参药材的HPLC图谱中主要峰相对保留时间分析，其相对误差均小于3%，表明主要色谱峰在HPLC图谱中的相对位置是稳定的，可以作为定性鉴别的指标参数；同时，测定各样本主要峰的总面积，以反映有效部位在不同样本中的绝对含量，而各总面积的相对偏差则可以比较有效部位在不同样本中的相对含量，舍去相对含量较小的样本，由其余样本确定了丹参药材定性鉴别的指标峰有9个，相对保留时间分别为0.108，0.291，0.568，0.667，0.701，1，1.156，1.470，2.180，将其用于对11个样本的定性鉴别。结果，虽然11个样本中丹参酮IIA和隐丹参酮在含量上差别很大，但均含有9个指标峰，故认为它们是丹参药材。


参考文献略


作者:杨广德，贺浪冲，李永茂
来源:药物分析杂志