知母药材高效液相指纹图谱研究

摘要:用高效液相色谱法建立了知母药材的指纹图谱分析方法。采用Zorbax Eclipse XDB2C18色谱柱(5μm ,4.6 ×250mm,Agilent),流动相为乙腈和25mmol/L KH2PO4缓冲液,梯度洗脱;流速:1.0mL/min ;柱温为25℃;检测波长257nm。确定了8批不同产地知母药材甲醇提取部分6个共有峰,各产地药材指纹图谱与对照指纹图谱相似度良好(> 0.9) ,可以用来作定性研究。方法准确可靠,为提高知母药材质量控制标准提供参考。
关键词:知母;指纹图谱;高效液相色谱法
中药知母(Rhizoma anemarrhenae) 为百合科植物知母(Anemarrhena asphadeloides Bge) 的干燥根茎,为常用中药,具有滋阴降火、润燥滑肠之功效,其主要成分有皂苷类,黄酮类,木脂素等。研究表明芒果苷是其清热作用的有效成分,此外还具有祛痰镇咳、强心、利尿、抗忧郁、消炎抗病毒以及免疫抑制作用。知母的植物资源分布很广,不同产地知母中芒果苷和新芒果苷含量差异较大,造成了药材质量的不规范,品质各异。为了避免知母药材质量差异影响到其进一步的开发利用,需要建立起一套能严格控制药材内在质量的技术手段。
中药指纹图谱是近些年迅速发展起来的一种中药质量控制模式,相对于以前用单个或少数主要成分作为指标来控制中药材质量的方法,中药指纹图谱能较为全面的反映药材的内在质量,具有系统性、整体性和稳定性等特点。关于知母药材指纹图谱的研究目前尚未见报道,本实验选用知母药材甲醇提取部分作为考察对象,建立知母药材HPLC指纹图谱,并且应用本实验室开发的中药色谱指纹谱相似度计算软件进行数字化处理,结果证明,分析结果能够反映各产地知母药材的内在质量差异。
1 　实验部分
1. 1 　仪器与试药
Agilent 1100 高效液相色谱仪(包括:四元泵,脱气机,自动进样器,柱温箱,二极管阵列紫外检测器);中药指纹谱相似度计算软件(本教研室开发编制) 。
知母生药来源见表,由第二军医大学药学院生药教研室陈万生副教授采集鉴定,并按照《中国药典》2000 版(一部) 规定进行干燥,切片,粉碎,过40目筛等预处理。芒果苷、新芒果苷对照品也均由生药教研室制备,经面积归一化法检查,纯度均在98%以上;甲醇、乙腈购自Fisher 公司,色谱纯;水为纯净水。
1. 2 　实验方法
1. 2. 1 　色谱条件　色谱柱:Zorbax Eclipse XDB2C18柱(5μm ,4.6×250 mm,Agilent) ;流动相:采用梯度洗脱,A相为乙腈,B 相为25mmol/ L KH2PO4 缓冲液(pH 3.0) ;流速:1.0mL/min ,运行时间60min,DAD检测,柱温为25℃。两次进样之间用流动相初始梯度条件平衡15min。进样量20μL 。
1. 2. 2 　供试品溶液的制备　取知母药材粉末约0.2g ,精确称取,置25mL容量瓶中,加入25mL的体积分数80%甲醇溶液,超声处理20min ,过滤,残渣再用25mL的80%甲醇溶液超声处理20min ,过滤,合并滤液,用少量甲醇溶液洗涤容器及残渣,滤过,并入滤液,挥干甲醇溶液,用甲醇溶解,置25mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
1. 2. 3 　参照物溶液的配制　取芦丁对照品适量,加甲醇溶解并稀释成1.944mg/mL的溶液,摇匀,作为内标溶液。
2 　结果与讨论
2. 1 　方法学考察
2. 1. 1 　运行时间　依据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》,考察了运行时间为120min的HPLC图谱,确定60min之后再无峰出现,因此确定每次运行时间为60min。
2. 1. 2 　稳定性　取同一份供试品溶液,按上述色谱条件,分别在0 ,2 ,4 ,8 ,16 ,24 ,36 ,48h 检测。结果表明,各共有峰的保留时间和峰面积没有明显变化(RSD 均在3 %以内) ,样品HPLC 指纹图谱基本稳定。
对上述放置不同时间检测的同一份供试品溶液的指纹图谱进行相似度计算。相似度计算结果表明,各时间点测得样品HPLC指纹图谱相似性很好,表明样品HPLC指纹图谱稳定性良好。
2. 1. 3 　精密度　取同一份供试品溶液,连续进样5次,考察色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的一致性。结果表明,各共有峰的相对保留时间和峰面积的比值基本没有明显变化(RSD均在3%以内)。
2. 1. 4 　重复性　取同批次药材粉末5份,依法测定,考察色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的一致性。结果表明,各共有峰的相对保留时间和峰面积的比值基本没有明显变化(RSD均在5%以内) 。
2. 2 　指纹图谱分析
2. 2. 1 　共有峰　取各产地药材供试液,依次进样,重复操作3次,记录色谱图。考察8批知母药材样品的色谱图,提取药材的共有模式作为对照指纹图谱,60min内有6个色谱峰是8批知母共有的,因此,确定它们为共有指纹峰。其中,2号峰为新芒果苷,3号峰为芒果苷,S为参照物芦丁对照品。
2. 2. 2 　指纹图谱相似度计算　以8批不同产地的知母药材HPLC图谱建立其共有模式指纹图谱,对8批样品的HPLC图谱进行相似度计算。
2. 3 　讨论
2. 3. 1 　药材前处理条件　文献报道中,制备知母提取物多采用甲醇溶剂索氏提取法,试验中以新芒果苷和芒果苷的含量为指标,选择考察了索氏提取和超声波提取两种方法的提取效率。采用正交设计法对超声波提取方法的提取溶剂比例、提取时间和提取次数进行了考察,并与不同回流时间的索氏提取结果比较。试验结果表明,采用“1. 2. 2”项下方法,芒果苷和新芒果苷的提取效率最高,确定为最佳条件。
2. 3. 2 　检测波长　从新芒果苷对照品溶液和芒果苷对照品溶液的紫外吸收光谱图可以看出,二者在波长为257nm 处均有最高吸收峰,故选取257nm作为检测波长。
2. 3. 3 　梯度洗脱程序　中药材的成分复杂,选择单一流动相一般无法使各成分很好的分离,而采用梯度洗脱通过调节控制洗脱程序可以使样品各成分在整个分析时间段(60min) 内充分分离。在中药色谱指纹图谱中,在首先保证指标成分完全分离的前提下,应尽可能的使所有色谱峰都能分离,以便准确的反映各色谱峰对应的成分的含量信息。同时,为了保证方法的稳定和重现,分离度应稍大,各色谱峰间距应比较均匀一致。试验中先后考察了不同组成、不同比例流动相以及不同洗脱坡度的分离效果,获得了分离效果较好的梯度洗脱程序。
2. 3. 4 　共有峰的确定　对于共有峰的确定,目前在研究中还很不统一,有文献报道采用八强峰的方法。然而在中药材中,活性成分有时并不是含量较高的组分,而可能是一些含量很低的组分,因此,用八强峰作为评价指标并不能适用所有情况。本实验依据国家颁布的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行) 》,通过采用不同产地知母药材样品,建立其共有模式作为对照指纹图谱,根据对照指纹图谱的特征以及已知的活性成分(如芒果苷) ,确定共有峰,并以已知的活性成分作为指标性成分评价其质量优劣。
2. 3. 5 　指纹图谱相似度评价　相似度表示的是样品指纹图谱与对照指纹图谱间的相似程度,综合了样品的定性信息和定量数据。由表相似度计算结果可见,各产地知母药材指纹图谱与对照指纹图谱间相似性良好,反映了药材的同源性,可以用来作定性研究。各产地样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度高低顺序为安徽亳州(0. 996)>江苏南京(0.9758)> 山西太原(0.968)>山东烟台(0.958)>湖南邵阳(0.947)> 湖南长沙(0.934)>山东济南(0.934) ,与其活性成分含量的高低具有相关性,能够反映各产地知母药材的内在质量差异。