降香药材色谱指纹图谱的建立及其在药材鉴定中的应用

摘要：目的：建立评价降香药材质量的液相色谱指纹图谱分析方法,并采用液相色谱-质谱联用技术对其主要成分进行定性分析。方法：采用Phenomenex Luna C18色谱柱,以乙腈-0.3%醋酸水溶液为流动相梯度洗脱,流速为1.0 mL/min ,检测波长为275nm,测定了37批不同来源的降香药材的HPLC-UV指纹图谱以及其中3批代表性药材的HPLC-DAD-MS图谱。结果：根据指纹图谱相似度分析结果,将降香药材分为3类;利用HPLC2DAD2MS技术分析了3类药材化学组成上的异同,并分别在3类药材中指认了10个,7个和2个酚性成分。结论：本方法可用于降香药材的指纹图谱测定,并为其质量评价提供可靠依据。
关键词: 降香;指纹图谱;高效液相色谱-质谱联用
降香为豆科植物降香檀Dalbergia odorifera T.Chen树干和根的干燥心材。主要产于海南、福建、云南、广东、广西。有行气活血、止痛、止血的功能。现代药理学研究证明,降香有增加冠脉流量、减慢心率以及抗炎、抗凝等作用。降香药材的有效成分主要为挥发油和酚性成分,近年来人们对其进行的大量研究主要集中在挥发油。降香中的酚性成分如芒柄花素( formononetin ) 、甘草素( liquiritigenin) 、异甘草素( isoliquiritigenin) 、李属异黄酮( p runetin ) 、紫铆素( butin ) 和紫铆查尔酮( butein) ,具有抗氧化、抗癌、抗炎、镇痛和松弛血管等作用,是降香的重要活性成分,酚性成分的研究对于控制降香质量以及从中寻找新的活性先导化合物具有重要意义。本文首次报道了降香药材的液相色谱指纹图谱分析方法,并利用液相色谱-质谱联用技术对不同的降香药材进行了分析,通过与对照品对照,指认了部分成分,并分析了其化学成分的差异,为全面控制降香药材的质量提供了可靠依据。
材料与方法
仪器与材料　Agilent 1100 高效液相色谱仪(Agilent Technologies, Germany) ,配有二极管阵列检测器。LCQ 型液相色谱-质谱联用仪( FinniganMAT, San Jose, CA) ,配有ESI源及LCQ数据处理系统。乙腈为色谱纯(德国Merck公司) ,双蒸水,其他试剂均为分析纯。37批降香药材均购自当地药材市场或药店,由北京大学药学院果德安教授进行生药学鉴定,药材来源。10个酚性成分对照品由作者自降香药材中分得, 并通过UV, IR,NMR,MS等方法对其进行结构确认,纯度均大于95%(HPLC测定)。
色谱条件
液相色谱条件: Phenomenex Luna C18 ( 250mm ×4.6mm ID, 5μm)色谱柱(Aschaffenburg,德国) ;流动相采用乙腈(A)-0.3%醋酸水溶液(B)进行梯度洗脱: 0～30 min为28% A, 30～53min由28% A 升至34% A, 53～70 min 由34%A 升至80%A;流速: 1.0mL/min;检测波长:275nm;进样量:20μL;柱温: 30℃;理论塔板数以17号色谱峰( vestitone)计,不低于3000。
质谱条件: ESI源;负离子检测;扫描范围: m / z80～1 000;源电压5100 kV;毛细管温度320℃;毛细管电压- 10.00 V;管透镜补偿电压- 30.00V。
色谱条件的优化　降香药材含有丰富的黄酮类成分且极性范围跨度很大,故采用梯度洗脱;黄酮类成分含有多个酚羟基,呈弱酸性,故使用酸性缓冲系统;考虑到质谱分析的需要,最终确定乙腈-0.3%醋酸水溶液为流动相。采用二极管阵列检测器对检测波长进行了考察,结果表明黄酮类成分在275nm处均有较好的紫外吸收,色谱信息最为丰富,故选择275nm作为检测波长。
提取溶剂和提取方法的考察　分别比较了水、乙醇-水、甲醇-水等不同溶剂系统对降香药材的提取效果,发现乙醇-水系统优于其他;进一步考察了乙醇-水的比例(1∶9, 3∶7, 5∶5, 7∶3, 9∶1) ( v / v) ,发现提高溶剂中乙醇比例,可以提高提取效率,但脂溶性杂质随之显著增加, 干扰测定, 最终确定乙醇-水(3∶7)为提取溶剂,因为使用该溶剂获得的图谱中色谱峰数多而干扰杂质少。采用了黄酮类成分分析常用的超声振荡提取方法,考察了超声提取时间(30,60,90和120min),结果表明, 超声振荡60min,黄酮类成分基本被提取完全。
对照品溶液的制备　分别精密称取10个酚性成分对照品适量,置于5 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度, 配制成浓度已知的混合对照溶液(30～100μg/mL) ,备用。
供试品溶液的制备　取药材粉末( 40目) 0.2g,加乙醇-水(3∶7)溶剂10mL,称重,超声提取1h,补足减失重量, 0.45μm微孔滤膜滤过,即得。
结果
1　精密度、重现性和稳定性试验
取No. 2 (购自北京同仁堂)样品的供试品溶液在上述液相色谱条件下,连续进样5次,记录色谱图,考察精密度;另取该样品5份,精密称重,分别按供试品溶液制备方法制备供试品溶液,进样分析,记录色谱图,考察重现性;将供试品溶液分别在0,4,8,24和48h进样分析,记录色谱图,考察供试品溶液稳定性。将所得数据采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统( 2004A) ”软件进行处理,结果表明其相似度均高于0.95,符合指纹图谱要求。
2　不同来源降香药材中黄酮类成分的指纹图谱相似度评价
将37批降香药材的供试品溶液进行HPLC-UV分析,记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A) ”软件进行数据处理:以购自中国药品生物制品检定所的降香对照药材和收集自原产地并经生药学鉴定的10批道地药材(No.1,3,11,13,14,22,26,33,35和36样品)的色谱指纹图谱经软件系统生成可反映药材质量的对照图谱( standard chromatographic project) ,以此为基准,计算样本图谱与对照图谱的相似度,对药材质量进行评价。根据相似度计算结果,将37批降香药材分为3类。第1类24批药材与对照模式相似度均高于0.88,可被认为是质量较好的降香药材;第2和3类药材与对照模式相似度均低于017,说明其与对照药材差别较大,可否作为合格药材使用还需要进一步进行药效物质成分分析和谱效学研究,仅靠化学指纹图谱信息无法做出准确判断。分别针对第2和3类药材进行相似度分析表明,以第2类7批药材的色谱图生成对照图谱,分别计算7批药材图谱与其的相似度,结果均大于0.94;同理,第3类6批药材的色谱图与由其生成的对照图谱的相似度均大于0.85。说明3类药材的化学成分及其相对含量差别较大,而每一类药材的化学组成又存在着较高的一致性。
追朔文献报道发现,虽然2005版中国药典规定降香的唯一来源是豆科植物降香檀的干燥心材,但从历代本草看,降香有数种来源,印度黄檀及芸香科植物山油柑也被收入。降香药材除主流商品降香檀外,还有少量的印度黄檀、印度紫檀、囊状紫檀等。由此推断,第2和3类药材可能为上述的降香药材混淆品种,由于缺乏降香混淆品种的对照药材进行对照研究,所以目前阶段尚无法确定第2和3类药材的品种。但第2和3类药材作为市场流通的商品降香药材(在本研究中,二者占收集药材的35%) ,明确其与正品降香药材在化学成分上的差别,对于鉴定药材真伪和控制药材质量等都有重要意义。为此本文采用HPLC2MS技术,从3类药材中各选取1个代表药材进行成分分析,寻找其共有成分及各自的特征成分,以达到从化学成分上明确区分3类药材的目的。
3　不同来源降香药材的HPLC2MS分析
No.1(第1类)、No.17(第2类)、No.32(第3类)降香药材的供试品溶液及对照品溶液分别在上述HPLC-MS条件下进样分析,液相色谱图及总离子流图,相关数据( tR , [M-H] - ,UVλmax值)。。(1)对第一类降香药材(No. 1)的27个主要黄酮类成分的色谱峰进行了分析,通过对照品对照,指认了其中的10 个酚性成分,分别为butin ( 2 ) ,(3R ) -4′-methoxy-2′, 3, 7-trihydroxyisoflavanone ( 5) ,koparin (6) , liquiritigenin (8) , 2′, 7-dihydroxy-4′, 5′-dimethoxyisoflavone ( 11 ) , violanone ( 14 ) , vestitone(17) , 2′- hydroxyformononetin (19) , dalbergin (22)和2, 4-dihydroxy-5-methoxybenzophenone ( 24 ) 。No. 1样品(购自中国药品生物制品检定所)为药典规定的降香对照药材,其色谱指纹图谱和化学成分信息可以为正品降香药材的鉴定和质量评价提供可靠依据。(2)在对第2类药材(No. 17)的分析中,发现了21个与第1类药材共有的黄酮类成分,通过对照品对照,确认了其中的7个成分,分别为butin ( 2 ) ,liquiritigenin (8) , violanone (14) , vestitone (17) , 2′-hydroxyformononetin ( 19 ) , dalbergin ( 22 ) 和2, 4-dihydroxy-5-methoxybenzophenone ( 24 ) 。LC-MS 结果表明, 第1和2类药材化学组成相近,主要是由于各成分相对含量的差异造成了指纹图谱相似度差别较大。第1类药材各成分相对比例接近,而第2类药材中, 24和25号色谱峰占主导地位,其他色谱峰则很弱。( 3 )由LC-MS 分析知, 第3类药材(No. 32)与第1类正品降香药材存在较大差别,其中只发现4个共有成分,通过对照品对照,确认了其中的2个成分, 分别为koparin ( 6 ) 和2′, 7-dihydroxy24′, 5′-dimethoxyisoflavone (11) 。第3类药材图谱中主要色谱峰为a (MW 560) , b (MW 590) , c(MW 590) , d (MW 574) , e (MW 574)和f (MW 286) ,其中化合物a～e为黄酮二聚体,这在第1和2类药材中是不存在的。
讨论
指纹图谱质量控制模式能综合反映药材中各主要成分及其相对含量,它比测定一种或几种成分所提供的信息更加丰富全面。但指纹图谱是通过药材色谱图的整体“面貌”(如出峰时间、峰数、峰位以及各峰之间的比例等信息)对药材进行质量评价,而忽视了各色谱峰所代表的药效物质成分信息,液相色谱-质谱联用技术恰好可以弥补这一缺陷。本实验建立了评价降香药材质量的液相色谱指纹图谱分析方法,应用于37批不同来源降香药材的
分析。采用相似度评价软件,针对色谱图中的全部图像信息进行数据处理,通过相似度计算结果对药材进行分类和评价;继而采用HPLC-MS技术,定性分析了根据相似度评价结果所划分的不同类别药材在化学组成上的异同,能够全面、可靠的反映降香药材的质量。同时也说明,在指纹图谱研究中,相关的药效物质成分信息是不可或缺的,这样才能使指纹图谱方法更好的应用于药材真伪鉴别、质量评价、制剂生产工艺控制以及新药开发研究。