葛根中有效部位及有效成分的高效液相色谱分析

摘要:目的:建立全面控制葛根及其制剂的定性和定量分析方法。方法:用反相高效液相色谱法(RP-HPLC),以甲醇-水(42∶58)为流动相在250nm波长下检测,对葛根有效部位(醋酸乙酯提取部位)进行指纹图谱定性分析,对葛根有效部位中的有效成分葛根素和大豆苷元进行定量测定,并对11种不同来源的葛根药材进行分析测定。结果:在定性分析条件下,葛根有效部位的HPLC指纹图谱中有5个共有峰,可以作为其定性鉴别的指标峰;在以葛根素和大豆苷元为定量指标分析中,其方法的回收率分别为98.0%和95.4 % ,相对标准偏差(RSD)分别为1.30%和1.61% ,葛根药材中葛根素和大豆苷元的含量分别在0.213%～3.626%和0.012%～0.049%范围内。结论:以葛根有效部位指纹图谱定性分析和有效成分定量分析方法,可以准确有效地控制其质量。
关键词:葛根;有效部位;有效成分;RP-HPLC;指纹图谱
葛根为豆科植物野葛[ Pueraria lobata (Wild.)Ohwi]或甘葛藤[Pueraria thomsonii Bent h.]的干燥根,甘葛藤习称“粉葛”,系临床常用中药。现代药理学研究表明,葛根总黄酮为其有效部位,具有扩张冠状动脉、减慢心率、降低心肌耗氧量、改善心、脑血液循环等作用。另有文献报道,以葛根素为指标用高效液相色谱法、紫外分光光度法、薄层色谱法测定其含量。本文作者用细胞膜色谱法(cell membrane chromatograp hy , CMC) 筛选并结合整体药理试验研究,发现葛根经乙醇提取后的醋酸乙酯提取部位以及其中的葛根素和大豆苷元,具有明显的扩张冠状动脉血管,改善脑微循环的作用,为葛根的有效部位和有效成分。由于葛根药材生长环境、采收季节以及品种的不同,其中的有效部位和有效成分含量差异很大,将直接影响葛根制剂的质量。我们用反相高效液相色谱法,建立了以葛根有效部位指纹图谱定性分析、有效成分定量测定的分析方法,并对11份不同来源的葛根商品药材进行了分析。
1 　实验器材
Shimadzu 高效液相色谱仪, 包括LC-10A Tvp型溶剂输送泵, SPD-10Avp 型可变紫外检测器,Anastar 色谱工作站。甲醇为色谱纯(美国Fisher 公司) ;水为三重蒸馏水(自制) ;其余均为分析纯试剂。供含量测定葛根素对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号:7522200108) ,大豆苷元对照品(自制) 。
11份葛根商品药材分别购自不同的商店,1:西安藻露堂小寨分店;2:西安藻露堂东一分店;3:西安三秦新特药;4:西安普济堂中药店;5:陕西省西安市大庆药材市场;6:西安普太和中药店;7:山西省太原市迎泽中药店;8:青海省西宁市西门医药商店;9:广西医科大学药店;10:北京同仁堂药店;11:北京宏仁堂药店。1～9份经西安交通大学药学院生药学教研室鉴定为粉葛,10 、11份为野葛。
2 　方法与结果
2. 1 　色谱条件　色谱柱:ODS柱(150 mm ×4.6 mm,5μm) ;流动相:甲醇-水(42∶58) ;流速:1.0mL/min;检测波长:250nm;室温。理论塔板数按大豆苷元计不得低于2500。在此条件下,葛根素、大豆苷元对照品保留时间。
2. 2 　分析溶液的制备
2. 2. 1 　对照品溶液　精密称取葛根素、大豆苷元对照品适量,分别用甲醇溶解并稀释成0.50mg/mL与0.35 mg/ mL的对照品储备液,对照品溶液由此稀释得到。
2. 2. 2 　供试品溶液Ⅰ　取葛根药材粉末(过3号筛)2.0g ,精密称定,用50mL 85%(体积分数)乙醇冷浸10h,超声20min ,过滤,挥去乙醇。分别用醋酸乙酯萃取3次,再挥干醋酸乙酯,用甲醇定容至10mL 量瓶中,摇匀即得。
2. 2. 3 　供试品溶液Ⅱ　取葛根药材粉末(过3号筛)野葛0.1g ,粉葛0.8g ,精密称定,按文献方法处理,即得。
2. 3 　分析方法学考察
2. 3. 1 　线性关系　分别精密吸取不同体积的葛根素、大豆苷元对照品储备液,用甲醇稀释调配成系列对照品溶液,分别进样10μL,测定峰面积积分值,以对照品溶液浓度(mg/ L)为横坐标,峰面积为纵坐标进行回归,得到葛根素和大豆苷元线性回归方程:
Y = 257308 X - 2403.1,r = 0.9997
Y = 328004 X - 4876.9,r = 0.9994
葛根素在5～30mg/L ,大豆苷元在7～35mg/L范围内呈良好线性关系。
2. 3. 2 　对照品稳定性试验　取葛根素、大豆苷元对照品混合溶液(葛根素、大豆苷元对照品储备液各1.0mL ,混合) ,于配制后的0 、2 、4 、8 、12 、20 、24 、96h测定,结果表明在96h内稳定。
2. 3. 3 　精密度试验　取同一份葛根供试品溶液Ⅰ10μL重复进样5 次,测定峰面积积分值,葛根素和大豆苷元的相对标准偏差(RSD)分别为1.24%和0.87%。另取同一份葛根供试品溶液Ⅱ10μL 重复进样5次,测定峰面积积分值,葛根素和大豆苷元的RSD分别为1.03%和0.75%。
2. 3. 4 　重现性试验　取同一份葛根药材5 份,按供试品溶液Ⅰ方法平行进行提取测定,求得葛根素和大豆苷元含量的RSD分别为0.89%和1.47%。另取同一份葛根药材5份,按供试品溶液Ⅱ方法平行进行提取测定,求得葛根素和大豆苷元含量的RSD分别为2.04%和2.10%。
2. 3. 5 　回收率测定　准确称取已测知含量的葛根样品粉末(西安普济堂中药店)6份,各0.1g,分别加入对照品溶液适量(含葛根素0.30mg,大豆苷元0.02mg) ,按文献方法处理,在上述色谱条件下依法测定。测得葛根素和大豆苷元平均回收率分别为98.0%和95.4%,RSD分别为1.30%和1.61%(n=6) 。
2. 4 　葛根有效部位的定性分析
2. 4. 1 　分析方法　精密吸取11份葛根供试品溶液Ⅰ各10μL ,在上述色谱条件下进样,记录其指纹色谱图。计算图谱中各主要色谱峰相对于大豆苷元色谱峰(7号峰)的相对保留时间(α = ti / t7 )和相对峰面积值( AR = A i / A总×100 % )。
2. 4. 2 　共有峰确定　在11份葛根供试品溶液I的HPLC图谱中,由相对保留时间(α)比较稳定的色谱峰(相对偏差小于3%),可以确定的主要峰有7个,其相对保留时间0.125～1.000;分别计算11个样本主要峰的总面积( A总)、平均总面积( A总)以及总面积的相对偏差,舍去总面积相对偏差小于-50%的样本(样品编号为1、6、7) 。最后,由其余样本(8个)确定葛根有效部位的共有峰为1、2、4、5和7号峰,作为葛根有效部位指纹图谱定性分析的指标峰。
2. 5 　有效成分含量测定
2. 5. 1 　分析方法　取葛根药材粉末(过3号筛) 野葛0.1g ,粉葛0.8g ,精密称定,按文献方法处理,在上述色谱条件下进样10μL ,测得峰面积积分值,代入回归方程计算葛根素和大豆苷元含量。中国药典(2000 年版) 规定野葛中葛根素的含量不得低于2.4%,粉葛中葛根素含量不得低于0.3%。从表可看出,11个样本中有5、6、7、9份粉葛药材不符合药典要求,其余7个样本均为合格的葛根药材,其中野葛以北京宏仁堂药店的药材质量为最优,粉葛以青海省西宁市西门医药商店的质量为最优,山西省太原市迎泽中药店的粉葛含量最小。
3 　讨　　论
对中药复杂体系的质量控制是中药现代化研究的关键问题。我们以葛根为例,应用反相高效液相色谱技术,建立了以有效部位定性与有效成分定量分析的方法,对葛根药材及其制剂的质量进行控制。
3. 1 　定性鉴别　在本色谱条件下,葛根有效部位的HPLC图谱中可以检出7个色谱峰。通过对11份葛根有效部位的HPLC图谱中主要峰相对保留时间(α)分析,其RSD 均小于3% ,表明主要色谱峰在HPLC图谱中的相对位置是稳定的,可以作为定性鉴别的指标参数;同时,测定各样本主要峰的总面积( A总) ,以反映有效部位在不同样本中的绝对含量,而各总面积的相对偏差则可以比较有效部位在不同样本中的相对含量,舍去相对含量较小的样本,由其余样本确定共有峰为5个,作为指标峰。我们所建立的葛根药材有效部位定性鉴别的指标峰有5个,相对保留时间分别为0.128、0.161、0.220、0.349和1.000,将其用于11个样本的定性鉴别,结果虽然11个样本中葛根异黄酮在含量上差别很大,但均含有5个指标峰,故认为它们是葛根原药材。
3. 2 　定量分析　我们建立了同时测定葛根异黄酮成分葛根素和大豆苷元RPHPLC分析法,并以二者为定量指标,对11个样本进行测定分析,发现各样本中含量差异显著,结果显示北京宏仁堂的野葛含异黄酮量最大,粉葛中以青海省西宁市西门医药商店的最大,而山西省太原市迎泽中药店的为最小。并且发现大豆苷元在野葛与粉葛中的含量差别较小,为大豆苷
元的开发提供了有利的条件。
3. 3 　小结　为了确保葛根药材及其制剂的临床疗效,就必须建立严格的药材质量控制体系。单味中药材的药用部位较多,成分复杂,不可能用一种分析方法对整个药材的质量进行全面控制,加之同一种药材在不同方剂中,发挥药效作用的部位和成分也不相同。所以,本文的质控方法是针对与主要药理作用相关的有效部位和有效成分建立的,只有这样才能确保中药材及其制剂的质量和疗效。