金银花药材高效液相色谱指纹图谱研究

摘要:目的:建立金银花药材HPLC指纹图谱。方法:用梯度洗脱法,对金银花药材进行HPLC测定,流动相为1醋酸溶液-甲醇线性梯度洗脱,检测波长为254nm。结果:运用梯度洗脱能很好分离金银花的各类成分;经方法学考察, HPLC指纹图谱具有良好的重现性: 10批样品中11个特征指纹峰有专属性。结论:本研究建立的金银花药材HPLC指纹图谱分析法可用于金银花药材质量的综合评价。
金银花具有清热解毒、凉散风热之功效,为常用中药材。主治痈肿疔疮,喉痹,热毒血痢,风热感冒,温病发热等症。中国药典收载的金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japom ica、红腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.、山银花Lonicera confusa DC. 或毛花柱忍冬Lonicera dasysty la Reha. 的干燥花蕾或带初开的花。实际上,除上述品种外,可供药用的品种达47种,而且即使同一品种也会因为产地、生长条件、栽培方法、采集时间、储存条件等不同,而使金银花的化学成分及其含量、药理作用等有所差异。传统研究均以绿原酸作为金银花药材的质量控制指标,但仅以绿原酸为指标不能全面反映金银花的内在质量。本实验采用HPLC指纹谱技术,对收集的10个不同产地的金银花样品进行了比较分析,为制定综合评价金银花质量的新方法进行了探索,也为以金银化为处方组成的制剂的指纹图谱研究奠定基础。
1　HPLC指纹谱原理
在给定的色谱条件下,中药材中各组分的相对保留时间和相对峰面积为各组分所特有,如同人的指纹一般,利用各样品的相对保留时间和相对峰面积建立样品的HPLC相对保留值指纹谱,通过对样品HPLC色谱的数据化可产生一系列的参数,包括n强峰,特征峰群及特征指纹峰检出率等,为鉴定和区分中药材的品质提供客观依据。
1. 1　相对保留值α的计算　一般在梯度洗脱的色谱条件下,色谱峰较多且相当密集,难以插入一个合适的参照物,故选择出峰时间居中、各样品中均具有一定含量的组分(通常选用已知的有效成分)作为参照物。在本实验中,以绿原酸为内参照峰(α=1) ,求出样品中所有峰的相对保留值α。α = tRi / tRα式中, tRi为各组分的出峰时间, tRα为内参峰的出峰时间。
1. 2　指纹谱的建立　按α值大小依次排列,在每个α项下标出该组分的相对峰面积值(RA ) 。RA 是以生药鉴定结果为质地较优样品的总面积为分母,样品中各色谱峰面积为分子,计算得到各色谱峰的相对面积值。各样品中具有相同α值的组分,通过RA 的比较,就可以清楚地了解各样品中该组分的含量多少。这样,由相对保留值α和相对峰面积值RA组成样品的HPLC相对保留指纹谱。
RA =A i/ΣAT ×100式中,A i为第i峰的面积值;ΣAT 为质地较优样品所有色谱峰面积总和。
2　仪器和材料
Agilent21100高效液相色谱系统、电子天平( Sartorius公司,德国) 、微孔滤膜(0.45μm,购自Dikma公司) ,甲醇为色谱纯(上海化学试剂有限公司) ,冰醋酸为分析纯(上海化学试剂有限公司) ,水为超纯水,绿原酸(Chlorogenic acid) 、金丝桃苷( hyperforin)对照品(中国药品生物制品检定所) 。金银花药材(由上海德华饮片厂提供,经基源鉴别为忍冬科植物忍冬Lonicera japom ica. 的干燥花蕾,其中河南密县金银花为质优样品)来源。
3　实验方法
3. 1　色谱分析条件　色谱柱: Agilent ZORBAX SB-C18 (150mm×4.6mm, 5μm) ;流动相: A相为1醋酸水溶液, B相为甲醇;流速:1.0mL/min;检测波长:254 nm;柱温:30°C;进样量:10μL;所有组分在70min内出峰。
3. 2　对照品溶液的制备　称取绿原酸对照品适量,用50甲醇超声溶解并稀释使成40μg/mL的溶液(置棕色容器中) ;另取金丝桃苷对照品适量,加甲醇超声溶解并稀释制成0.1mg/mL的溶液。
3. 3　供试品溶液的制备　药材经干燥后粉碎,精密称取各样品粉末1g,置250mL锥形瓶中,加水100mL,浸泡1 h,急火煎沸后改用小火保持微沸2h,倾出药汁(四层纱布过滤) ,并用水洗涤纱布。合并煎液和洗涤液,加入乙醇适量(使含醇量达70) ,冰箱中静置18h后,抽滤,减压回收乙醇并浓缩至干,残渣用水适量溶解,移置25mL棕色量瓶中,定容至刻度,溶液用0.45μm微孔滤膜过滤,即得。
3. 4　样品分析　　将10个金银花样品制成的供试品溶液,按以上色谱条件进样分析,得各样品的HPLC图谱。同时用对照品溶液进样,确定绿原酸和金丝桃苷峰的位置。
4　实验结果
4. 1　相对保留值指纹谱的建立　为得到较好的分离效果(HPLC色谱图见图1) ,选择梯度洗脱,在70min内完成测
定。本实验选定绿原酸为内参照峰(α=1) ,以河南密县金银花(质优药材)样品的总峰面积为分母,在上述获得的10个色谱图中,根据上述公式求算出各样品主要峰的α和RA值。将各个样品每个峰的RA 值列在相应的α值项下,某α值项下无相应峰的样品其RA 值计为0,得到相对保留值指纹谱。
4. 2　样品8强峰　每个样品均选择其中峰面积最大的8个峰排列成表,得10个金银花样品的8强峰表。
4. 3　特征指纹峰　以上述10个样品的8强峰为主体,并结
合它们在10个样品中出现的频率,选出α值为0.33, 0.64,1.00, 1.10, 1.21, 1.25, 1.40, 1.74, 2.03, 2.07, 2.31共11个色谱峰为本实验所研究金银花的特征指纹峰。
4. 4　方法学考察　为考察分析方法的可靠性,以河南密县金银花药材样品为例,对其稳定性、仪器精密度、实验方法重现性进行考察。
4. 4. 1　溶液稳定性试验　取供试品溶液分别于0,4,8,12,24h不同时间进样,考察色谱峰相对保留时间及相对面积的一致性。测得各主要色谱峰各主要色谱峰相对保留时间的RSD不大于0.67 ,相对面积的RSD不大于3.03。
4. 4. 2　仪器精密度试验　取同一供试品溶液,连续进样5次,考察色谱峰相对保留时间及相对面积的一致性。结果各主要色谱峰相对保留时间的RSD 不大于0.83 ,相对面积的RSD不大于2.33。
4. 4. 3　重现性试验　取河南密县金银花6份,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,分别进样,考察各样品色谱峰相对保留时间及相对面积的一致性。经计算, 11个共有峰的相对保留时间分别为0.33 ±0.005, 0.64 ±0. 005, 1.00 ±0, 1.09 ±0.004, 1.21±0.008, 1.24±0.009, 1.39±0.012,1.73 ±0.023, 2.01±0.044, 2.05 ±0.047, 2.28 ±0.062;相对面积分别为1.75 ±0.044, 2.14±0.055, 15.54 ±0.297, 3.82±0.099, 34.71 ±0.537, 4.93±0.107,3.64±0.045, 3.07 ±0.046, 2.04±0.043, 2.78 ±0.034, 2.81±0.063。各主要色谱峰相对保留时间的RSD小于1.5 ,相对面积的RSD小于3。
5　讨论
5. 1　通过不同提取溶剂、提取方法(包括超声、回流、水煎醇沉)的考察,并结合有关文献确定了以上供试品溶液的制备方法。实验结果表明,采用传统水煎醇沉方法能获得较多的色谱峰,且各峰均得到较满意的分离效果。同时,该方法也符合传统中药生产工艺,有利于下一步应用指纹图谱对金银花药材及以其为处方的制剂生产过程及最终产品质量的评价。
5. 2　比较了等度洗脱和梯度洗脱对金银花指纹图谱的影响,结果发现等度洗脱时,改变流动相的组成或比例只能得到较少的色谱峰。改用梯度洗脱,样品中不同极性组分均获得了合适的保留值。实验证明,该方法梯度简单,可操作性强,重现性好,分离度和柱效均令人满意。
5. 3　HPLC指纹谱应尽可能体现植物中的已知活性成分,文献报道金银花主要化学成分为有机酸类、黄酮类、挥发油类及三萜类化合物。从指纹图谱中可看出,虽然所收集的10个产地的样品均出现了相应的主成分峰,即以绿原酸为代表的有机酸类化合物和以金丝桃苷为代表的黄酮类化合物等,但相对峰面积却不尽相同,且有些产地样品中有机酸类化合物仅有绿原酸较为明显。提示中药必需在固定原药材产地的前提下,才可能保证其质量的稳定可控。
5. 4　色谱相对保留值是一组仅与化合物性质、色谱分离条件相关的半定量参数,当色谱分离条件固定时,仅与化合物性质有关,可以消除人和仪器设备对化合物保留时间的影响,依此为依据,建立样品指纹图谱可使获得的样品信息更准确。
5. 5　指纹图谱具有整体性和模糊性的特点,当其用于中药鉴别,提供的信息较用任何单一化学对照品作为鉴定的依据要丰富的多。本实验基于整体色谱的面貌辨认样品的真实性出发,选取了11个特征峰,它们的峰位和大致的比例关系,作为一个整体,清楚的表达了指纹图谱鉴别的专属性。样品之间的差异没有影响到对金银花指纹图谱整体面貌的“共性特性”,不影响真实性的判断。