中药莪术GC-MS指纹图谱研究

摘要:目的：研究中药莪术的GC2MS指纹图谱。方法　运用GC2MS分析3种基原的18个莪术样品,所得TIC图谱采用“中药色谱指纹图谱计算机相似性评价系统”软件进行模式分析及相似度计算。通过质谱数据与文献对照检识出主要特征峰成分,并根据主要特征成分对18个样品进行SPSS聚类分析。结果　3种基原18个莪术样品的相似度(全谱)计算结果较低;通过聚类分析结果可将莪术分为两类,温郁金和蓬莪术各为一类,广西莪术样品则无法成类。因此基于聚类分析结果,建立了温郁金和蓬莪术的指纹图谱共有模式,并分别具有较高的相似度,而广西莪术6个样品因成分差异较大,暂未建立指纹图谱共有模式。结论　共有指纹图谱是多基原中药质量控制的基础,但多基原中药莪术GC2MS指纹图谱无法建立,提示不同基原莪术化学成分差异与药理作用的关系值得研究。
关键词:温郁金;蓬莪术;广西莪术;GC-MS指纹图谱;聚类分析;相似度
莪术为姜科姜黄属植物蓬莪术( Curcum aphaeocau lis Val. ) 、广西莪术( Curcum a kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang)和温郁金(Curcum a wenyujin Y. H. Chen et C. L ing)的干燥根茎,有破瘀行气、消积止痛之功效。现代研究表明其具有抗肿瘤、抗病原体、增强免疫、抗炎和抗早孕等多种药理作用,挥发油为其主要有效部位,莪术醇、莪术二酮及吉马酮等是其主要活性成分。非挥发性成分如姜黄素、脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素在莪术中的含量很低甚至检测不到。为多成分评价中药莪术质量,本文采用甲醇超声提取代替传统水蒸汽蒸馏法,对3种不同基原18个莪术样品进行了GC2MS分析,并尝试建立中药莪术的GC-MS指纹图谱。
材料与方法
仪器　GC-MS联用仪,配备Agilent 6890气相色谱仪, 5973质谱检测器, Agilent 7683 series自动进样系统, Agilent ChemStation; 加压溶剂提取器为Dionex ASE200 (美国Dionex公司)。
药材与试剂　甲醇为色谱醇,购自Merck公司;6批温郁金样品均采自浙江乐清; 6批蓬莪术样品分别采自四川听江、江源、三江、周渡、万荡和双流; 6批广西莪术样品分别采自广西南宁、贵县、武明、云山和云南文山、麻栗坡;样品编号依次为1～18,分别经香港科技大学董婷霞博士鉴定为温郁金、蓬莪术和广西莪术样品。吉马酮、莪术二酮、莪术醇对照品为自制,并经光谱确证。
色谱条件　气相色谱条件: HP-5 MS (30m×0.25 mm×0.25μm)毛细管柱;程序升温:柱初始温度为60℃, 保持2 min 后以5℃/min升至145℃,在145℃保持25min,然后以5℃/min升至200 ℃,最后以20 ℃·min- 1升至280 ℃,并在280 ℃保持3min。脉冲无分流进样(276kPa保持2min) ; 汽化室温度190℃; 载气为高纯度He (991999% ) 。
质谱条件:EI离子源;四极杆温度150℃; EM电压2165V;接口温度280℃;溶剂延迟3 min;m/z40～550。
对照品溶液制备　精密称取莪术二酮,吉马酮和莪术醇各约2.5mg,置于5mL量瓶中,甲醇溶解并定容到刻度, 0.45μm滤膜过滤后供GC-MS分析用。
供试液制备　称取样品粉末约0.50g,置于50mL离心管中, 加甲醇25mL, 称定重量, 超声30min,称重,补足损失的甲醇。3500r/min离心15min,上清液用0.45μm滤膜过滤,滤液作GC-MS分析。
数据处理　图谱采用“中药色谱指纹图谱计算机相似性评价系统”软件(Matlab 语言版本, Ver11240) ,由中南大学中药现代化研究中心开发研制。
结果与讨论
1　对照品重复进样精密度
分别取对照品溶液,连续进样6次,每次0.2μL,脉冲无分流进样,计算各组分精密度。结果莪术二酮、莪术醇和吉马酮RSD 分别为0.37%,1.17%和0.23%,精密度良好。
2　重复性考察
取广西贵县产广西莪术样品6 份,按“供试液制备”项下方法制备供试液,分别进样0.2μL,脉冲无分流进样,计算莪术醇、吉马酮和莪术二酮响应值的RSD。结果莪术醇、吉马酮和莪术二酮的RSD分别为2.72% , 2.43%和2.81% ,方法重现性良好。
3　对照品溶液稳定性考察
取对照品溶液,分别于0, 1, 2, 4, 8, 16 和24 h各进样0.2μL,脉冲无分流进样。计算莪术醇、吉马酮和莪术二酮响应值的RSD。结果莪术醇、吉马酮和莪术二酮的RSD分别为1.09%, 0.77%和0.88% ,说明被分析成分在24h内稳定。
4　加样回收率考察
分别精密吸取0.316mg/mL莪术醇甲醇溶液, 3.224mg/mL吉马酮甲醇溶液和12.816mg/mL莪术二酮甲醇溶液各0.25mL,氮气吹干后,再加入广西贵县产广西莪术粉末0.25 g。按“供试液制备”项下方法制备加样回收供试液,进样0.2μL,脉冲无分流进样,计算加样回收率(n=3)。结果莪术醇、吉马酮和莪术二酮的加样回收率分别为102.1% , 99.1%和99.5%。
5　样品测定
取不同来源的莪术粉末,按照“供试液制备”项操作,进样0.2μL,脉冲无分流进样,得GC2MS数据。18个莪术样品的总离子液(TIC)图。
6　主要特征成分的检识
根据质谱,通过与文献报道数据和对照品比较,从莪术中检识出16个主要特征成分,分别为:桉油精( eucalyp tol) ,樟脑( camphor) ,异龙脑( curcumol) ,异莪术烯醇( isocurcumenol) ,呋喃二烯( furanodiene ) , 吉马酮( germacrone ) , 莪术二酮( curdione ) , 莪术烯醇( curcumenol) , 新莪术二酮( neocurdione)和莪术烯酮( curcumenone) 。
7　SPSS聚类分析
对18个样品的21个成分GC-MS数据以吉马酮为参照峰进行归一化,所得结果进行SPSS聚类分析。从聚类结果中可以看出,温郁金(CW1-CW6)和蓬莪术(CP1-CP6)分别成类,而广西莪术(CK1-CK6)则种内成分差异较大,无法成为一类。
8　指纹图谱的建立
8. 1　将18个莪术样品GC2MS数据导入“中药色谱指纹图谱计算机相似性评价系统”,经校准后得图,相似度(全谱)计算结果表明: 18个莪术样品间的相似度低,相合系数分别为0.37 ～0.88(均值)和0.46～0.86(中值) ,相关系数则分别为0.44～0.90(均值)和0.52～0.88(中值)。并由SPSS聚类分析结果可知,温郁金和蓬莪术样品分别成类,而广西莪术样品则较为分散(亦即所含成分差异较大) ,无法成为一类。因此,无法建立莪术药材的指纹图谱,但可分别建立温郁金和蓬莪术的指纹图谱,广西莪术由于成分差异太大,其指纹图谱有待扩大样本后作进一步研究。
8. 2　将温郁金1～5号样品导入“中药色谱指纹图谱计算机相似性评价系统”,经校准后,生成并输出共有模式图。以此共同模式图对6～18号莪术样品进行相似度计算,结果:作为校验的6号温郁金样品相似度值> 0.98, CK2莪术样品相似度值为0.82,其他莪术样品相似度值均< 0.43,说明生成的温郁金指纹图谱共有模式图有较高的可靠性,各主要特征成分峰相对于吉马酮的保留时间(RTR)和峰面积(RPA)。
8. 3　将蓬莪术7～11号样品导入“中药色谱指纹图谱计算机相似性评价系统”,同前处理,生成蓬莪术共有模式图(全谱)。以此共同模式图对其余13个莪术样品进行相似度计算,结果:作为校验的CP6蓬莪术样品相似度值> 0.98, CK1, CK4, CK5和CK6 号莪术样品相似度值分别为0.54, 0.72,0.60和0.73,其他莪术样品相似度值均< 0.27,说明生成的蓬莪术指纹图谱共有模式图有较高的可靠性,各主要特征成分峰相对于吉马酮的保留时间(RTR )和峰面积(RPA)。
讨论
由于中药的功效与其所含的化学成分有关,因此,对于多基原中药的指纹图谱研究,作者认为应以药材为对象建立统一的指纹图谱,以确保中药的安全有效性。文献报道莪术醇、莪术二酮及吉马酮是莪术的主要活性成分。本文的研究结果表明:中国药典收载的3种基原莪术中蓬莪术和温郁金均不含莪术醇,而广西莪术仅有广西贵县产的莪术含莪术醇,并且3种莪术的化学成分差异显著,无法建立一个共有指纹图谱。因此,有必要对此3种莪术的疗效与化学成分进一步研究,并对其药理作用和临床功效进行比较研究,以阐明多基原中药应用的科学性。
作者在建立莪术GC2MS指纹图谱时,曾试图用中国药典委员会提供的指纹图谱相似度软件进行计算,但该系统与GC-MS色谱工作站获得的数据不兼容。此外,目前的指纹图谱研究多采用选取共有峰的模式进行,对于中药质量控制也具有重要意义。但中药是多种化学成分所组成的复杂的混合体,单从共有峰入手可能会丢失一些重要的化学信息,如果将模糊性的概念引入指纹图谱,进行图谱的整体性评价,则对中药质量控制更具意义。